原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma. HCC)的发病率位列全球第六,全球每年新发病例782,500,死亡病例达745,500之多,占所有成人肝脏恶性在肿瘤的75%-90%3。具有发病隐匿,恶性程度高、易转移复发等特点,预后不良,是一种严重威胁人们健康的疾病。目前,肝癌的的治疗方法主要包括肝切除和肝脏移植4。经肿瘤切除治疗5年后有近70%的病例出现复发,肝脏移植是患有小的多发性肿瘤以及严重肝功能障碍的肝癌患者的一线治疗方案。对适合于肝脏移植最佳患者,患者接受治疗后5年生存率较高、术后发生复发的概率较低。但是供肝来源短缺是这种治疗方法的主要阻碍,很多患者在等待肝源过程中发生死亡。目前,肝细胞癌发生发展的确切分子机制还不明确。因此,从分子水平开展对肝癌发病机制的深入探讨,对探索新的靶向治疗途径、改善肝癌预后意义深远。Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein (PBLD)又称为MAWBP,最早在2001年由Iriyama等人利用酵母双杂交技术从人的肝脏cDNA库中分离发现7,是一类近年来发现的相对较新的分子蛋白。作为phenazine biosynthesis-like protein蛋白家族的唯一代表,PBLD广泛分布于人的大脑、心脏、肺脏、肝脏、胰腺和肾脏等各种组织中。已有研究发现,PBLD的表达水平在胰岛素抵抗、叶酸缺乏症和高血压等一些疾病中升高8。但是,该分子在人体各组织及其在各种肿瘤发生发展中的具体生物学功能及其发挥作用的分子机制目前还没有研究报道。当前的研究,关于该分子的有限认识仅仅来源于基因组和蛋白组学海量、笼统的筛选结果中。作为强有力的分子生物学技术,基因组学及蛋白组学技术现在已被广泛用于各种疾病尤其是肿瘤相关新型分子标志物的筛选中,对疾病的早期诊断和有效分子靶向治疗的发展发挥了举足轻重的作用9。近年来,越来越多的基因和蛋白组学的研究提示我们PBLD在肝癌组织中的表达与正常肝组织相比普遍降低。这种现象提示我们PBLD表达的缺失与肝癌发生发展可能有一定相关性。然而,目前还没有深入、系统的研究来探索PBLD在肝细胞癌组织中的表达特征、生物学作用及发挥作用的分子机制。因此,本研究将从肝癌组织标本入手,首先对PBLD在肝癌组织中的表达分布及其与肝癌患者临床特征、预后间的关系进行分析,进而利用分子生物学实验探索PBLD在体内和体外对肝癌细胞株增殖、细胞周期分布、侵袭等生物学行为的作用,最后利用基因组学对PBLD发挥生物学作用的下游相关信号通路进行初步探索。方法1.肝癌组织中PBLD表达分布及与患者预后情况分析(1) 肝癌标本的收集：所有标本均取自南方医科大学南方医院肝胆外科手术切除的肝癌及边缘组织(经医学伦理委员会批准,且征求并获取患者及其家属同意)。(2) 肝癌组织中PBLD的检测：利用免疫组织化学、western blot和实时荧光定量PCR方法检测肝癌组织中PBLD的表达水平,并与各肝癌组织对应的癌旁肝组织进行比较,同时利用实时荧光定量PCR比较了不同分化程度的肝癌组织中PBLD的表达差异。(3) PBLD表达水平与肝癌患者临床特征及预后间关系的分析：收集108例肝癌患者的临床特征,分别利用X2检验分析PBLD与肝癌患者各临床特征之间的关系,利用回归分析分析了PBLD对肝癌患者预后的预测价值,同时,利用Kaplan-Meier法分析PBLD与肝癌患者生存、无瘤生存时间的关系。PBLD与肝癌患者预后的关系进一步由另一独立队列进行验证。2.体外检测PBLD对肝癌细胞株生物学行为的影响(1) PBLD对肝癌细胞增殖的影响为研究PBLD对肝癌细胞株增殖能力的作用,我们首先利用细胞转染技术过表达或者沉默肝癌细胞株中PBLD的表达。利用CCK-8法将稳定过表达PBLD的HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD细胞及其相应的空载对照细胞以相同的数量分别接种于96孔板中,待细胞贴壁后每隔24小时随机选取5孔进行CCK-8检测,连续检测至72小时。同时,我们将HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其对应的空载对照细胞分别接种于10cm培养皿中,14天后进行染色、计数分析,利用平板克隆观察PBLD过表达后对肝癌细胞株增殖能力的影响。(2) PBLD对肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响。为研究PBLD对肝癌细胞株侵袭和迁移能力的作用,将等量的HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其空载对照细胞分别接种于含有基质胶和无基质胶的transwell小室中,48小时后结晶紫染色、计数,利用transwell小室观察PBLD过表达后和敲低后肝癌细胞株侵袭(含基质胶)、迁移(无基质胶)能力。(3) PBLD对肝癌细胞株细胞周期分布的影响。为明确PBLD过表达所引起的肝癌细胞株增殖抑制作用是否与细胞周期相关,我们利用PI染色分别对HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其对应的空载对照细胞进行DNA标记,进而利用流式细胞技术对两组肝癌细胞的周期分布进行分析,并与空载细胞进行对比,分析PBLD过表达对肝癌细胞株细胞周期分布的影响。3.体内检测PBLD对肝癌细胞株增殖、血管生成能力的作用(1) PBLD对肝癌细胞增殖能力的作用：4-6周BALB/c雄性裸鼠在随机分为PBLD过表达细胞组和空载对照细胞组。分别将等量PBLD过表达的稳转细胞和对照细胞注入裸鼠皮下,观察并测量皮下移植瘤的生长直径来检测PBLD对肝癌细胞增殖的作用。(2) PBLD对肝癌细胞血管形成能力的影响：取裸鼠皮下成瘤组织,固定、脱水、包埋后进行免疫组织化学检测血管内皮标志性指标CD31的表达,并镜下计数不同细胞来源的肝癌组织中微血管的形成数量来分析PBLD对肝癌细胞血管形成能力的影响。4. PBLD发挥生物学作用的分子机制研究(1) PBLD下游基因的筛选：通过真核表达载体转染构建PBLD过表达HepG2稳转细胞株,运用基因组学技术筛选并分析PBLD过表达后与空载对照细胞之间的差异基因谱。(2) PBLD下游靶基因及相关信号通路的初步筛选：通过对所有差异基因进行功能聚类及富集分析,筛选出PBLD潜在的下游靶基因及可能调控的信号通路。(3) PBLD对相关信号通路调控的验证：1) PBLD对肝癌细胞EMT通路的影响利用细胞免疫荧光检测PBLD过表达细胞株中上皮细胞标记物E-cadherin及间质细胞标记物N-cadherin的表达,western-blot检测裸鼠皮下成瘤组织中两者的表达。同时,利用western-blot分别检测PBLD过表达和沉默后肝癌细胞株中EMT相关指标的变化。最后,在82例肝癌标本中对PBLD和E-cadherin的表达水平的关系进行验证。2) PBLD对ERK/MAPK信号通路的影响利用ERK通路抑制剂U0126抑制ERK/MAPK信号通路活性,检测pERK的表达情况,进而对添加U0126的肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的变化情况进行检测。3) PBLD对HIFla/VEGF-A的影响利用细胞免疫荧光检测PBLD过表达细胞株中VEGF-A的表达变化,利用cck8法检测在VEGF对PBLD过表达细胞株增殖能力的影响,进一步利用western-blot技术检测常氧和缺氧条件下PBLD对肝癌细胞中VEGF和及其上游调控因子HIFla表达水平的影响。结果1. PBLD在肝癌组织中的表达存在显著降低或缺失本研究中免疫组织化学染色和western blot检测发现肿瘤组织PBLD较对应的癌旁正常肝组织表达显著下降；实时荧光定量PCR检测发现108例肝癌患者中有92例患者(84.4%)肝癌组织中PBLD mRNA的表达水平存在不同水平的降低,肝癌组织中的平均表达水平显著低于癌旁组织(P<0.001)。同时,随肝癌组织的分化程度的降低PBLD表达水平逐渐降低。2. PBLD的表达水平与肝癌患者的预后显著相关PBLD的表达水平与肝癌患者临床特征及预后的关系显示：PBLD的表达水平与肝癌组织的分化程度(P=0.017)及肿瘤的AJCC分期(P=0.038)密切相关,PBLD表达水平越高,肝癌组织的分化程度越高,AJCC分期越早。另外,PBLD高表达组肝癌患者的无瘤生存时间(RFS)和总体生存时间(OS)均显著高于低表达组患者。多变量分析显示,PBLD表达水平是患者术后RFS (HR 0.502,95% CI 0.282-0.891, P= 0.019)和OS (HR 0.364,95% CI 0.138-0.957, P= 0.04)的独立预测指标。同时,我们利用组织芯片检测进一步对上述结论进行了验证,Kaplan-Meier生存分析显示PBLD的表达水平与RFS (P= 0.012)和OS(P=0.032)显著相关,多因素分析结果显示PBLD是肝癌患者术后复发(HR 0.490,95% CI 0.285-0.841, P= 0.010)和生存(HR 0.528,95% CI 0.303-0.922, P= 0.025)的独立预测指标。3.体外实验中PBLD可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移我们成功构建了肝癌细胞Huh7和HepG2的PBLD稳定过表达细胞株。CCK-8结果发现两组细胞贴壁后的24、48、72小时,PBLD过表达均可显著抑制肝癌细胞的增殖能力(P<0.05)。平板克隆实验结果同样显示：PBLD稳定过表达的HepG2和Huh7两种肝癌细胞各组之间细胞在克隆形成数量上均具有显著性差异(816.67 vs 316.67,P<0.001; 736.33 vs 257.00, P<0.001).流式细胞术观察PBLD对细胞周期的影响,结果发现,PBLD过表达使肝癌细胞发生G2期和S期阻滞。Transwell实验显示PBLD过表达后可显著抑制HepG2和Huh7细胞的迁移、侵袭能力,而反向敲低验证实验结果与过表达实验结果相一致。4.裸鼠成瘤实验中PBLD可抑制HepG2细胞的增殖和血管形成HepG2_PBLD细胞在裸鼠皮下形成肿瘤的平均体积在不同测量时间点均小于HepG2_vector组。实验结束HepG2_PBLD与HepG2_vector两组细胞形成肿瘤的最大体积差距达3倍左右。同时,利用免疫组织化学的方法检测裸鼠皮下成瘤组织中血管内皮细胞标志物CD31的表达情况,结果显示,来源于PBLD过表达细胞株的肿瘤组织其CD31的表达量显著低于来源于空载对照细胞的肿瘤组织(3.4 vs 5.4,P<0.05)。因此,PBLD可显著抑制肝癌细胞在裸鼠体内的增殖能力和微血管形成的能力。5. PBLD可能通过调控EMT、ERK/MAPK和HIF1α/VEGF-A等多条肿瘤相关信号通路发挥抑癌作用(1) 我们首先通过基因组学检测来分析稳定过表达了PBLD的HepG2细胞株与空载对照的细胞相比其基因表达谱的变化,结果发现,PBLD过表达后发生表达差异的基因涉及细胞增殖、细胞周期、细胞侵袭和迁移、细胞粘附、血管生成等多种细胞功能相关的基因,进一步对这些差异基因所涉及的相关信号通路进行分析,结果显示,PBLD过表达后发生显著改变的信号通路包括MAPK EMT及NF-κ B等,提示我们PBLD可能通过这些信号通路发挥生物学作用。(2) PBLD抑制肝癌细胞的EMT细胞免疫荧光和western-blot检测结果显示：在PBLD稳定过表达的HepG2细胞株及来源于该细胞株的裸鼠成瘤组织中,作为上皮细胞标志的指标E-cadherin表达减少,而作为间充质细胞标志的N-cadherin的表达显著减少。82例肝癌组织实时荧光定量PCR结果显示,在肝癌组织中PBLD的表达水平与E-cadherin存在显著正相关(r=0.61,P=0.000),PBLD表达水平越高,其所对应的E-cadherin的表达水平也越高。western-blot检测E-cadherin重要调控因子发现,PBLD可显著抑制E-cadherin上游调控因子snail的表达,进而抑制肝癌细胞的EMT。(3) PBLD抑制肝癌细胞中ERK/MAPK信号通路对PBLD过表达稳转细胞和裸鼠成瘤组织中pERK的检测结果显示,PBLD过表达后可显著抑制pERK的表达,同时,使用ERK抑制剂U0126后,肝癌细胞的增殖能力和侵袭、迁移能力同样受到显著抑制。(4) PBLD通过HIF1α/VEGF-A抑制肝癌细胞的血管生成细胞免疫荧光结果显示：PBLD过表达之后HepG2细胞中VEGF-A的表达被显著抑制。PBLD在24、48、72小时均可显著抑制肝癌细胞的增殖能力,同时,在加入VEGF-A 48小时开始,这种增殖的抑制作用开始被VEGF-A所逆转。因此,PBLD可通过抑制VEGF-A的表达来抑制肝癌细胞的增殖能力。同时,western-blot检测发现,PBLD可显著抑制常氧和缺氧状态下肝癌细胞HIF1α以及VEGF-A的表达水平。结论1. PBLD在肝癌组织中普遍存在表达缺失现象。2. PBLD的表达与肝癌的分化程度和临床分期存在相关性,PBLD可作为判断肝癌患者预后的独立预测指标：PBLD表达水平越低预示患者生存时间越短,复发率越高,预后越差。3. PBLD在可抑制肝癌细胞的生长、侵袭和迁移能力,在裸鼠体内可抑制肝癌细胞的增殖和血管形成能力。4. PBLD可能通过EMT、MAPK等多条肿瘤相关信号通路调控肝癌细胞的生物学行为。