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促进真皮组织工程支架内血管网络的快速形成,对于提高支架在体内的存活率及促进真皮组织的原位诱导再生至关重要。蚕丝丝素蛋白材料具有良好的生物相容性,无明显的免疫原性,可被生物降解,作为真皮再生支架具有广阔的研究和开发应用前景。为了增强丝素蛋白三维材料作为真皮再生支架的促血管新生作用,加快真皮组织的再生修复,本课题将肝素以共价键接枝于丝素蛋白材料表面,通过体外实验,一方面研究丝素蛋白材料表面经肝素改性后对抗凝血性能的影响;另一方面研究丝素蛋白材料经肝素表面改性后对吸附和富集血管内皮细胞生长因子（VEGF）,继而对血管内皮细胞粘附、生长的影响。通过将丝素蛋白三维材料作为真皮再生支架的动物实验,研究丝素蛋白材料经肝素改性后,在体内对抑制凝血块形成和促进VEGF吸附,从而促进血管内皮细胞迁移、粘附和增殖的作用,研究肝素改性的丝素蛋白材料的抗凝血和VEGF吸附双重作用对随后的血管网络新生和真皮组织再生的影响。首先,利用再生丝素膜外观透明、表面致密、便于对其表面组成和结构的变化进行观察及分析的特点,采用N2低温等离子体与碳化二亚胺双诱导技术将肝素以共价键高密度接枝到丝素膜表面,研究丝素膜表面经肝素改性后对抗凝血性能、VEGF吸附性能及血管内皮细胞的粘附和增殖的影响。经检测,当低温等离子体放电功率为90 W、处理时间为9 min时,丝素膜表面引入的氨基密度和肝素的接枝密度分别高达162.4 nmol/mg和7.8μg/cm2。体外实验表明,丝素膜表面经肝素改性后,显著地延长了凝血时间,减少了血浆蛋白、血小板的吸附,显著提高对VEGF的吸附能力,丝素膜对血管内皮细胞的粘附能力显著增强,且血管内皮细胞在丝素膜表面的增殖速度显著加快,表明丝素膜表面经肝素改性后能显著增强其抗凝血性能,显著促进对VEGF的吸附,进而促进血管内皮细胞的粘附与增殖。其次,用碳化二亚胺介导丝素与肝素的反应,用冷冻干燥技术制备表面共价接枝肝素的丝素蛋白三维支架,研究其在体外是否具备与肝素化丝素膜相似的作用,在体内是否同时具备抗凝血块形成和促进组织修复细胞粘附、迁入的作用。红外吸收光谱和X-射线光电子能谱的测试结果表明,在碳化二亚胺介导下,能将肝素以酰胺键固定于丝素蛋白支架内部,肝素接枝量约为12～18μg/mg,固定后的肝素在生理盐水中能缓慢、持续地释放,14天时释放总量为肝素固定量的25～30%。体外实验结果表明,丝素蛋白支架经肝素改性后,对血浆蛋白的吸附显著减小,APTT、PT和TT显著延长,丝素蛋白支架的抗凝血性能显著提高,对VEGF的吸附能力显著增强,对血管内皮细胞的粘附能力增强,细胞增殖的速度显著加快。将丝素蛋白三维支架植入SD大鼠全层皮肤缺损创面的体内实验结果表明,丝素蛋白支架经肝素改性后,显著减小了支架孔隙内血小板的吸附、纤维蛋白的沉积以及凝血块的形成,并且支架内迁入的组织修复细胞数量增多。最后,将丝素蛋白三维支架植入SD大鼠的背部全层皮肤缺损创面,研究丝素蛋白支架表面经肝素改性后,对血管网络的新生及真皮组织的再生的影响。用活体荧光染色与组织透明法联用技术定性和定量分析结果表明,丝素蛋白支架经肝素改性后,在术后2周内能显著加快血管网络的新生。CD31和VEGF免疫组化分析结果表明,支架经肝素改性后2周内CD31阳性表达率、新生血管密度及VEGF阳性表达率显著高于未经肝素改性的支架。HE染色、Masson染色及免疫组化分析结果表明,支架经肝素改性后,在术后2～4周内支架内新生微血管数量和胶原沉积量显著增多,真皮组织新生速度和创面愈合速度显著加快。肝素改性的丝素蛋白三维支架在体内一方面能抑制凝血块的形成,为组织修复细胞的迁入提供物理通道;另一方面能促进VEGF的吸附和富集,为细胞的迁移、粘附和增殖创造良好的微环境,进而促进丝素蛋白支架内血管网络的新生及真皮组织的再生。