论文部分内容阅读
新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种担子菌,作为主要的致病性真菌,主要感染免疫力缺陷人群,例如艾滋病、器官移植患者和接受大量类固醇药物治疗的病人。新型隐球酵母感染的最严重的临床表现是脑膜炎,偶尔伴随菌血症;也可导致肺炎,常见于器官移植患者。新型隐球酵母三个重要的致病因子为:(1)漆酶;(2)多糖荚膜;(3)宿主体温(37℃)条件下的生长能力。漆酶是新型隐球酵母重要的致病因子,是一种多酚氧化酶,可以氧化底物生成黑色素。在该真菌中,存在两个漆酶基因的同源物,CNLAC1和CNLAC2,在葡萄糖饥饿条件下,CNLAC1表达主要的漆酶的活性。细胞定位研究表明,新型隐球酵母的漆酶共价结合于细胞壁多糖,漆酶的表达受到各种环境信号的调节,包括营养饥饿、多价阳离子和温度压力,并受信号转导途径的调节。
根瘤农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌,能够转移Ti质粒的部分DNA序列到植物细胞中,整合进宿主染色体中并表达。转移DNA的能力使得农杆菌可以转移DNA分子进植物细胞,以及其他有机体,包括动物细胞、霉菌等。农杆菌介导的转化(ATMT)较之电转化和基因枪转化的优点是:1.转化效率高,转化材料简单易得;2.转化子稳定;3.大多数转化子中T-DNA为单拷贝插入,易于进行基因分析。
本实验通过农杆菌介导的新型隐球酵母转化,在抑制漆酶表达的培养基上(4%Asn,加入NE至终浓度为0.1 mg/ml)筛选漆酶去葡萄糖阻遏突变株,并通过反向PCR确定T-DNA整合入基因组的位置。本实验最终筛选得到四株T-DNA插入到CNLAC1启动子的转化子,插入位置分别为-581 bP,-786 bp,-1172 bp,-1412bp。说明CNLAC1启动子存在与葡萄糖阻遏相关的调节位点。通过启动子缺失和定点诱变,在新型隐球酵母的漆酶基因CNLAC1的启动子序列中,发现了与葡萄糖阻遏相关的顺式调节元件。顺式调节元件为富含GC的DNA序列——GGCCACCCC,在高葡萄糖浓度的条件下,该顺式调节元件与漆酶基因CNLAC1的表达被高浓度葡萄糖阻遏相关。