农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选

来源 :浙江大学农业与生物技术学院 浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:easyk8
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稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。了解M.grisea的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因,是达到这一目标的关键所在。DNA插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一,ATMT是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术,具有转化效率高、成本低,操作方便和重复性好多重优点。我们用含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的农杆菌介导稻瘟病菌(Guyll)转化,转化效率达每106个分生孢子>300个转化子,并得到了1114个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。用感病大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性,鉴定了致病性下降或缺陷的4个突变体,它们分别是A1-134,A1-452,A2-1-8和A1-3-6。进一步的表型分析发现:1)这些突变体对感病水稻品种的致病性也有不同程度的下降;2)A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7.8%,孢子形态为圆球形,只有一个分隔,而A1-452突变体产孢量明显增多,是野生菌株的20多倍;3)A2-1-8孢子为长形,在正常的疏水表面不形成附着胞;4)A1-3-6分生孢子为长形,基本没有没有致病性。用TAIL-PCR的方法获得了A1-134突变体的T-DNA左翼基因组序列,经测序和BLAST分析,外源T-DNA插入位点位于Ⅱ号染色体的MGG06868.5基因终止密码子下游228bp处,MGG06868.5基因全长2475bp,具有5个外显子和4个内含子,推测编码683个氨基酸的乙酰乳酸合成酶,与其他丝状真菌(麦胞菌、核盘菌、灰霉菌、球毛壳菌、子囊菌等)的乙酰乳酸合成酶同源性达70%以上。有关基因的后续功能验证和其他突变体的相关突变基因的研究正在进行之中。
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