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背景和目的:造血微环境与白血病间的关系已成为近年研究的热点,白血病的造血微环境有助于白血病的发生与进展,同时白血病细胞也可以重塑造血微环境使其有利于白血病细胞生存。靶向异常造血微环境,阻断造血微环境与白血病细胞间的恶性循环可能有助于提高白血病的治疗效果。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为造血微环境的重要功能组分,其在白血病中被发现存在细胞遗传学和功能异常,我们前期研究也发现白血病BMSCs中连接蛋白43(connexin43,Cx43)表达减低并引起间隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)功能缺失,BMSCs中Cx43表达减低有助于庇护白血病细胞,减少其自发和药物诱导的凋亡。近期有研究表明CML造血微环境存在缺氧,缺氧程度还会随着疾病进展而进一步增加,有研究表明缺氧可以诱导大鼠心肌H9C2细胞Cx43表达减低。因此,我们推测CML造血微环境缺氧可能引起CML微环境Cx43表达减低并能够进一步庇护CML细胞从而影响治疗效果。本研究通过构建体外模型,探讨缺氧诱导白血病BMSCs中Cx43表达减低继而阻抑伊马替尼(imatinib,IM)诱导K562细胞凋亡的可能机制,为白血病治疗提供潜在靶点。方法:1.免疫组化染色检测CML和正常对照骨髓活检标本中Cx43和缺氧标志HIF-1α表达。2.按照本实验室常规方法,体外分离培养健康供者BMSCs,采用Co Cl2构建缺氧模型,将BMSCs分为缺氧组和对照组,缺氧组用Co Cl2(100μmol/L)处理72h,对照组加入相应体积生理盐水,RT-q PCR和Western blot检测缺氧组和对照组Cx43表达变化。3.运用腺病毒Ad-sh HIF1α-GFP下调BMSCs中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达,实验分为Ad-sh HIF-1α-GFP感染组,Ad-GFP感染组和空白对照组,采用Co Cl2(100μmol/L)分别处理Ad-sh HIF1α-GFP和Ad-GFP感染组BMSCs72h,空白对照组加入相应体积生理盐水,Western blot检测各组BMSCs中HIF-1α和Cx43表达变化。4.运用腺病毒Ad-sh Cx43-GFP下调BMSCs中Cx43表达(BMSCs-sh Cx43),以Ad-GFP作为对照(BMSCs-NC),Western blot检测BMSCs中Cx43表达变化。5.体外构建K562细胞共培养模型,分为K562组,K562+IM组,K562+BMSCsNC+IM组,K562+BMSCs-sh Cx43+IM组,流式细胞术检测共培养K562细胞凋亡和细胞周期。6.体外构建K562细胞共培养模型,分为K562组,K562+IM组,K562+BMSCsNC+IM组,K562+BMSCs-sh Cx43+IM组,Western blot检测共培养K562细胞Akt,Erk1/2,Stat5,P-Crkl和β-catenin表达变化。7.Akt抑制剂MK-2206处理共培养K562细胞,流式细胞术检测共培养K562细胞凋亡。结果:1.部分CML骨髓活检标本中Cx43表达较正常对照减低,Cx43表达减低的CML骨髓活检标本HIF-1α较正常对照升高。2.在BMSCs缺氧模型中,缺氧组BMSCs较对照组Cx43m RNA表达显著降低(p<0.01),约为对照组m RNA表达水平的1/2;缺氧组BMSCs较对照组HIF-1α蛋白表达显著升高,同时Cx43蛋白表达也显著降低。3.在BMSCs缺氧模型中,Ad-sh HIF1α-GFP感染组BMSCs较Ad-GFP感染组HIF-1α蛋白表达显著降低,同时其Cx43蛋白表达显著升高接近空白对照组水平。4.Ad-sh Cx43-GFP感染组BMSCs较Ad-GFP感染组Cx43蛋白表达显著降低。5.K562组,K562+IM组,K562+BMSCs-NC+IM组,K562+BMSCs-sh Cx43+IM组中K562细胞凋亡比例分别为8.20%±1.39%,36.71%±1.61%,24.43%±2.88%,18.19%±3.49%,K562+BMSCs-NC+IM组较K562+IM组K562细胞凋亡显著降低(p<0.01),同时K562+BMSCs-sh Cx43+IM组较K562+BMSCs-NC+IM组K562细胞凋亡也显著降低(p<0.05)。6.K562+BMSCs-NC+IM组较K562+IM组K562细胞处于G0/G1期细胞比例由51%增加到61%(p<0.01),而S期细胞比例由42%减少到26%(p<0.01);K562+BMSCssh Cx43+IM组较K562+BMSCs-NC+IM组K562细胞处于G0/G1期细胞比例由61%进一步增加到72%(p<0.01),S期细胞比例变化没有统计学意义。7.K562细胞中能够检测到较高水平的P-Akt,P-Erk1/2,P-Stat5和P-Crkl表达;伊马替尼处理K562细胞48h后,无论是否与BMSCs共培养均可观察到K562细胞P-Erk1/2,P-Stat5和P-Crkl表达减少,而K562+BMSCs-NC+IM组较K562+IM组K562细胞P-Akt表达增加,同时K562+BMSCs-sh Cx43+IM组较K562+BMSCs-NC+IM组K562细胞P-Akt表达进一步增加;K562+BMSCs-sh Cx43+IM组较K562+BMSCs-NC+IM组K562细胞β-catenin表达增加。8.Akt抑制剂MK-2206能够增加与BMSCs或BMSCs-sh Cx43共培养K562细胞伊马替尼诱导的细胞凋亡。结论:1.骨髓微环境Cx43表达减低的CML患者中证实,Cx43与缺氧标志物HIF-1α的表达呈负相关,体外缺氧模型中,缺氧通过激活HIF-1α下调健康供者BMSCs中Cx43表达;2.下调BMSCs中Cx43表达能够减少伊马替尼诱导的共培养K562细胞细胞凋亡并能使共培养K562细胞的G0/G1期比例增加;3.下调BMSCs中Cx43表达通过激活共培养K562细胞BCR-ABL非依赖的Akt信号通路降低伊马替尼诱导的K562细胞凋亡,从而介导耐药。