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研究背景：胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率呈逐年增加的趋势,该病的早期诊断十分困难,而临床病人大多已进入晚期,手术切除率低,手术后5年的生存率也仅有2%-3%。在胆囊癌的综合治疗中,研究新的抗肿瘤药物,一直是该领域研究的热点问题。肿瘤的发生是一个多种基因参与,经过多步骤、多阶段变化的过程。研究已发现,众多癌基因的激活以及抑癌基因的失活可能与肿瘤的发生、发展有着直接的关系。Ras相关区域家族1(Ras-association domain family1,RASSF1)基因是从肺癌与乳腺癌细胞株第3号染色体短臂(3p21.3)位点上克隆到的一个抑癌基因。该基因可形成3个不同转录剪接本(transcript),即RASSF1-A、RASSF1-B和RASSF1-C。许多研究结果表明,RASSF1A在正常组织中均有不同程度的表达,但在胃癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和前列腺癌等绝大多数肿瘤中,其表达缺失。目前认为,RASSF1的表达失活主要与其启动子区CpG岛(CpG island)特异的高甲基化、杂合性丢失以及染色体缺失有关。在胆囊癌中,RASSF1A启动子存在高甲基化,但其在胆囊癌发生发展中的作用机制仍未研究清楚。目的：本研究旨在观察RASSF1A在胆囊癌组织及细胞中的表达情况、甲基化程度以及其与临床的关系,通过构建稳定表达RASSF1A的胆囊癌细胞株GBC-SD来研究RASSF1A的过表达对胆囊癌细胞GBC-SD的生物学行为的影响,为探索胆囊癌的发病机理和靶向基因治疗提供有价值的实验资料。方法：1.收集20例胆囊癌的新鲜组织标本及癌旁组织,提取组织总RNA,采用半定量RT-PCR和qRT-PCR检测RASSF1AmRNA表达,统计分析RASSF1A的表达与胆囊癌临床病理参数的关系,另外,采用RT-PCR检测RASSF1A在4株胆囊癌细胞系中的表达,研究RASSF1A在胆囊癌细胞系中表达缺失情况；2.用MS-PCR法检测胆囊癌组织及细胞中RASSF1A甲基化水平；3.利用慢病毒载体,建立稳定表达RASSF1A的胆囊癌细胞株GBC-SD-RASSF1A,为后期随后实验提供细胞来源；4. RASSF1A的过表达对胆囊癌细胞株GBC-SD的生物学行为的影响：用细胞生长曲线(MTT法)和克隆形成实验检测转染细胞的增殖情况；采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期；用划痕实验和Transwell细胞侵袭试验分别检测细胞迁移和侵袭能力；裸鼠成瘤实验观察RASSF1A的过表达对胆囊癌细胞GBC-SD体内成瘤的影响；Ki67免疫组化染色和Western blotting检测肿瘤组织中RASSF1A基因及蛋白水平的表达水平。结果：1.RASSF1A在胆囊癌组织中的表达缺失率约为35.0%,在癌旁组织中的表达缺失率为0%；RASSF1A的表达水平与胆囊癌的临床分期密切相关(P<0.05)。在临床中晚期(Ⅲ-Ⅴ期)的胆囊癌患者中呈低表达。然而,RASSF1A的表达与胆囊癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、大小及组织学分级却无显著性差异(P>0.05);RASSF1A在四株胆囊癌细胞株GBC-SD、NOZ、TGBCITKB、OCUG1中表达均有缺失,而在正常胆囊组织中有高表达；2.与癌旁组织相比,RASSF1A在胆囊癌中甲基化发生率明显增高。差异有统计学意义(P<0.05)；3. GBC-SD-RASSF1A稳转细胞株的绿色荧光率均达到90%以上,且传代两个月后荧光未见丢失,RASSF1A的表达量提高了接近8倍,表明成功构建了稳定表达RASSF1A的GBC-SD胆囊癌细胞株；而阴性对照细胞株中RASSF1A的表达量很低,几乎未见表达；4. RASSF1A过表达明显地抑制了胆囊癌细胞株GBC-SD体外增殖和克隆形成,并诱导了(GBC-SD细胞的凋亡,使细胞周期停滞在G1期,但对细胞侵袭及迁移能力的影响较小；5. RASSF1A过表达显著抑制肿瘤的生长：与对照组相比,RASSF1A过表达组的肿瘤生长变慢,肿瘤的体积和重量均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05); RASSF1A过表达肿瘤组织Ki67染色阳性率明显降低；RASSFIA稳定转染的GBC-SD细胞成瘤后,肿瘤组织能够长时间稳定表达RASSF1A.结论：1. RASSF1A在胆囊癌组织及细胞中表达下调或缺失,其表达下调或缺失与启动子区CpG岛高甲基化相关；2.课题组成功构建了稳定表达RASSF1A的GBC-SD胆囊癌细胞株；3. RASSFIA过表达抑制胆囊癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,并使细胞周期停滞在G1期,但对细胞侵袭及迁移能力的影响较小；4. RASSFIA过表达可以有效地抑制胆囊癌瘤体的生长。