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甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)是一种重要的烟草特异亚硝胺(TSNA),能够诱发实验动物肺、食管和口腔等部位的恶性肿瘤,NNK进入体内后在细胞色素P450的作用下代谢活化并进一步导致DNA损伤是其导致癌症的关键步骤。感染人乳头瘤病毒(HPV)是食管癌和宫颈癌发病的重要诱因,高风险型HPV18 E6/E7基因编码的E6/E7蛋白在HPV致癌过程中起关键作用。流行病学证据已表明HPV能与烟草烟雾产生协同致癌作用,这提示癌症的发生不是单一因素,明确不同致癌因子之间的协同致癌作用对揭示导致癌症的机制有重要意义。本研究对NNK与HPV18 E6E7的协同致癌作用进行了研究,进而为深入阐明食管癌、宫颈癌等吸烟和HPV感染相关癌症的防治提供新策略。本研究首先构建了含HPV18 E6E7基因的重组质粒p LVX-Puro E6E7,通过慢病毒包装方法转染人永生化食管上皮细胞SHEE,经嘌呤霉素抗性筛选得到稳定转染HPV18 E6E7的SHEE-E6E7细胞。同时使用p LVX-Puro空载体同样进行慢病毒转染SHEE细胞,得到SHEE-V细胞,作为后续实验的对照组。随后经RT-q PCR测定两细胞中的E6E7 m RNA含量,结果显示SHEE-E6E7细胞中的E6E7 m RNA水平显著上调,SHEE-V细胞几乎不表达E6E7,说明转染成功,为深入探究HPV18 E6E7基因与NNK的协同致癌作用奠定了基础。通过细胞克隆形成实验、Transwell细胞侵袭和迁移实验以及细胞划痕愈合实验对暴露于NNK的SHEE-E6E7细胞及SHEE-V细胞进行了研究,分析了NNK处理后两种细胞表型的变化。结果表明,NNK暴露可显著促进细胞迁移能力和增殖能力(p<0.01),且SHEE-E6E7细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力均显著高于SHEE-V细胞(p<0.01),并在0-0.01 m M浓度范围内呈现出剂量依赖关系。这表明NNK能促进人食管上皮细胞的恶化,且与HPV18 E6E7呈现出明显协同作用。为进一步明确该协同机制,通过探究NNK导致细胞DNA损伤后形成4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)的含量水平来研究NNK对细胞DNA损伤的影响。首先建立了HPB的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)定量检测的方法,采用选择反应扫描模式(SRM)检测HPB的m/z 166→106、m/z 166→134和m/z 166→79离子通道以及和[D4]HPB内标的m/z 170→106、m/z 170→136和m/z 170→79离子通道。通过方法学研究,表明该方法有良好的灵敏度(检出限为5 fmol、定量限为15 fmol)、稳定性(日内和日间RSD均小于5%)和准确性(加标回收率70.6%-80.7%)。然后,基于以上定量方法对NNK导致细胞DNA损伤后释放的HPB进行了定量分析。采用不同浓度NNK(0.001、0.01、0.1、1和2 m M)处理SHEE-E6E7和SHEE-V细胞后,经DNA提取、酸性水解、固相萃取纯化和浓缩收集后,再定量测定样品中的HPB。该结果显示,用不同浓度NNK处理后的SHEE-E6E7细胞中HPB水平均显著高于相应浓度NNK处理的SHEE-V细胞(p<0.01)。由此可见,HPV18 E6E7可促进SHEE细胞中NNK的代谢,使DNA损伤累积增加,为前述细胞实验的结果提供了合理依据。本研究构建了含HPV18 E6E7基因的SHEE-E6E7细胞及对照组SHEE-V细胞,通过细胞表型实验比较了暴露NNK对两细胞恶性变化的影响,并利用HPLC-ESI-MS/MS法对NNK造成两细胞DNA的损伤后而形成的HPB进行了定量测定,证明了NNK与HPV能够具备协同致癌作用,并确证了二者能够协同促进DNA损伤的累积。为阐明NNK与HPV的协同致癌作用机理提供了直接实验证据,而且对相关癌症的防治存在着重要意义。