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渗透压和温度在冻融过程中的改变,影响精子的形态和功能,使精子质膜流动性、渗透性、脂质组成以及线粒体活性等发生改变。精子对氧化性胁迫敏感性很强,超低温冷冻对精子的头部、质膜、顶体、尾部以及精核都会产生损伤,使精子活动力和活率减弱,影响受精和早期胚胎发育等事件,这些结果与精子蛋白质的缺失或减少有关。目前,尚无有关绵羊精子冻融损伤的明确机制的报道,蛋白质组学技术的兴起与普及,为从蛋白质层面揭示绵羊精子冻融损伤机制提供了契机。本研究以绵羊鲜精和冻融精子为实验材料,利用二维电泳结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质,通过构建蛋白质互作网络筛选关键标志蛋白,然后利用免疫印迹、免疫荧光和实时定量PCR等技术验证目的蛋白的表达状况,最后分析目的蛋白与绵羊精子冻融损伤的相关性。研究旨在通过筛选精子冻融损伤的蛋白标志物揭示绵羊精子的冻融损伤机制,为冷冻保护剂的研究提供候选分子靶标。结果显示:(1)冻融过程会显著降低绵羊精子活率、活动率、ATP含量、质膜完整性、顶体完整性和线粒体功能,增加精子DNA损伤和ROS含量,降低绵羊精子质量。(2)利用PDQuest8.0软件分析2-DE凝胶,将差异表达倍数设定为≥2,共得到25个差异蛋白质斑点,在冻融精子凝胶上丰度减少的有17个,丰度增加的有8个。差异蛋白质斑点经MALDI-TOF-MS鉴定,在国际生物信息学中心数据库(NCBI)搜索到相对应的21种蛋白质。利用GO注释和KEGG富集对这些差异蛋白进行基因功能注释和通路富集,表明冻融过程会引起绵羊精子蛋白质组整体水平的改变,差异蛋白涉及多种生物学过程。(3)通过构建蛋白互作网络发现,CK2(CK2α和CK2α’)可能参与冻融精子凋亡;HK1参与糖酵解过程,与冻融精子的能量供给有关;CK2和HK1可能是潜在的绵羊精子冻融损伤标志物。(4)利用Western blotting验证发现CK2α、CK2α’和HK1蛋白在绵羊冻融精子含量降低。免疫荧光定位显示,CK2α主要分布在精子中段,CK2α’主要分布在精子顶体,HK1主要分布在精子头部和中段。(5)CK2α’蛋白含量在冻融精液的精浆中增加,HK1蛋白含量在冻融精液的精浆没有变化,说明冻融过程会使CK2α’蛋白外流到精浆,而HK1蛋白会在精子内部降解。(6)CK2α’和HK1 mRNA含量在冻融精子减少,说明冻融过程会使CK2α’和HK1 mRNA发生降解。(7)通过SPSS相关性分析发现,与鲜精相比,冻融精子的顶体完整率与CK2α’蛋白含量成正相关,冻融精子的DNA损伤率与CK2α’蛋白含量成负相关;冻融精子的凋亡率与CK2α蛋白含量成负相关;冻融精子的活动率与HK1蛋白含量成正相关,冻融精子的ATP含量与HK1蛋白含量成正相关。说明CK2和HK1蛋白能作为绵羊精子冻伤的蛋白标志物。研究表明:利用比较蛋白质组学筛选绵羊精子冻伤的蛋白标志物是可行的,通过蛋白质表达谱的构建,能够获得较为全面可靠的差异蛋白信息。通过蛋白质互作分析,能够筛选出绵羊精子冻融损伤的标志蛋白,通过验证标志蛋白的含量和分布,并与绵羊冻融精子质量参数作对比,能够得到标志蛋白与冻融精子质量的相关性。对潜在的绵羊精子冻融损伤标志蛋白的研究,有利于揭示绵羊精子冻融损伤的内在分子机制,有针对性的开展绵羊精子冷冻保护剂研究提供理论依据。