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对分离自棉花根部的促生细菌芽胞杆菌Bacillus sp.K2116菌株进行抗生素抗药性试验,发现K2116对Ch1具有抗性,通过三亲本杂交的方式将标记基因luxAB接合转移进。K2116菌株,所得的标记菌株K2216L具有发光活性和对Tc、Km、Ch1三种抗生素的抗性,转移频率为(1.45±0.26)×10<-6>。将标记菌株经连续在LB和含抗生素的LB平板上进行15次传代,在液体LB培养基中连续移接10次,均可检测到发光现象;精确的实验证明在无选择压力下持续培养4d质粒丢失率为9.05%,表明luxAB在标记菌株中具有较好的遗传稳定性;采用碱裂解法从K2116L中提取质粒,证明pTR102质粒已成功地转移到K2116菌株中,K2116L菌株的生理生化特性并没有受到luxAB基因导入的影响;测定出发菌株K2116和标记菌株K2116L的生长曲线和解钾能力,发现K2116L菌株的生长没有受到外源质粒的影响,其解钾能力也没有受到标记基因导入的影响。
对标记菌株K2116L在不同土壤类型以及灭菌不灭菌土壤中存活情况的研究发现,K2116L菌株在灭菌和不灭菌的黄褐土、黄潮土和红壤3种土壤中均能长期存活,且在3种土壤中的数量依次为:黄褐土>黄潮土>红壤;在灭菌土壤中的数量稍高于不灭菌土壤;K2116L菌株具有在不同土壤中和土著细菌进行空间和营养竞争的能力,K2116L菌株在不同类型的土壤中均具有较强的定殖能力,适合土壤和植物根际试验。当向土壤中加入碳源和氮源等营养后,标记菌株在自然土壤中的定殖水平快速上升。
采用根盒试验追踪标记菌株在棉花根部的定殖动态发现,棉花播种12d时标记菌株在根际土壤0.2cm、2-4cm深度的定殖密度分别为1.0×10<6>cfu·g<-1>、4.5×10<5>cfu·g<-1>,达到最高定殖水平,而在4cm以下深度18d时达到最高水平;棉花播种18d时标记菌株在所有根段的根表均达到最高定殖水平,0-2cm根段定殖密度为1.76×10<6>cfu·g<-1>,8cm以下根段达到1.6×10<5>cfu.g<-1>,表明标记菌株是由种子向根尖方向扩散的,但并不与根的生长同步,而是稍迟于根的生长。棉苗生长前期由于养分充足,接种菌株在所有根段无论根际还是根表其定殖数量均呈上升趋势,后期随着营养消耗较多、代谢产物积累等原因导致菌群数量下降;补充营养后,标记菌株在所有根段的根际和根表的数量均迅速上升;在同一时间,标记菌株在越靠近棉花根基的根段定殖密度越高,并随着根的生长不断向下扩散。该菌在棉花根部的成功定殖说明标记菌株对棉花根具有较高的亲和性,因此,可将 K2116菌株制成微生物接种剂应用于棉花的盆栽和田间试验研究。
对出发菌株和标记菌株在盆栽试验中的表现研究后发现,接种标记菌株K2116L的棉花的平均株高和秆重均高于接种出发菌株K2116、灭菌的K2116L和K2116,也高于不施肥的空白对照CKⅠ和施全肥的对照CK Ⅱ。接种K2216L的盆栽棉花土壤中,速效钾含量最高,为42.73mg/kg。从棉花株高、秆重和土壤速效钾含量3个数值能够明显看出K2116L具有较强的解钾能力,并且luxAB基因的导入对其解钾能力并没有显著影响。室内和室外的实验数据证明K2116L菌株性状稳定,能在棉花根部存活、定居,从而促进棉花的生长,因此可以把K2116L释放到土壤中,进行深入的微生物接种剂的个体生态学研究,为棉花PGPR菌株开发应用提供理论依据和技术参数。