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第一部分重庆地区急性呼吸道感染住院患儿腺病毒感染流行病学研究和临床特征分析目的:腺病毒(Ad V)是引起6月-2岁婴幼儿重症肺炎的病毒病原体,目前已报道有70种血清型,前期研究显示不同血清型Ad V引起疾病的严重程度不同。本研究拟通过回顾性分析2009-2015年急性呼吸道感染住院患儿Ad V感染情况,探讨重庆地区Ad V流行病学特征,以及不同血清型Ad V的临床特征。方法:1.收集2009年6月至2015年5月期间因急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection,ARTI)在重庆医科大学附属儿童医院呼吸科病房住院且确诊为Ad V感染患儿的鼻咽抽吸物(Nasopharyngeal aspirates,NAPs),共计4982份。2.提取NAPs中病毒脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),使用聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增腺病毒DNA后分别行六邻体(hexon)、纤毛蛋白(fiber)基因测序,结果与Gen Bank中的序列BLAST比对分型。3.回顾性分析Ad V导致急性呼吸道感染住院患儿临床特征,分析比较3、7型腺病毒所致疾病严重度差异。结果:1.连续6年重庆地区腺病毒检出率为5.8%(289/4982)。2.主要的流行血清型为3型腺病毒(43.9%,127/289)和7型腺病毒(45.3%,131/289);3.腺病毒终年流行,高发季节在夏、冬季。4.腺病毒感染以男性和5岁以下儿童多见。5.7型腺病毒较3型腺病毒引起了更严重的疾病。结论:3、7型腺病毒是引起重庆地区急性呼吸道感染住院患儿最主要的血清型,7型腺病毒感染患儿较3型腺病毒感染病情更重。第二部分3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力影响目的:本研究第一部分结果提示7型腺病毒的致病性比3型腺病毒更强,课题组前期研究发现3、7型腺病毒序列差异主要在纤毛蛋白上,提示纤毛蛋白差异可能参与了3、7型腺病毒的致病力不同,有关这方面的研究尚未见相关文献报道。因此本部分拟进一步探讨3、7型腺病毒纤毛蛋白差异是否影响其致病力。方法:1.使用临床株3型腺病毒(CQ5291)、7型腺病毒(CQ4411)分别感染A549、16HBE和293细胞48小时(hour,h)后收取细胞悬液,通过定量聚合酶联反应(Quantitative polymerase chain reaction,QPCR)定量病毒的拷贝数;3型腺病毒、7型腺病毒以及3、7型腺病毒重组Ad3/H7株(human adenovirus type 3 packaged by type 7 hexon,Ad3/H7)感染A549细胞后0、4、8、12、24、36、48、60、72、96h收集细胞悬液,通过TCID50测定上述时间点的病毒滴度;3型腺病毒与7型腺病毒以1:1混合感染A549细胞后0、2、8、12、24、36、48、72h收取细胞悬液,通过Q-PCR定量病毒拷贝数。2.3、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株分别以MOI为250、25vp/cell感染A549细胞后2、4、24、36、48及60h加入CCK-8溶液作用30min,波长450nm读取吸光值,计算细胞毒性结果。3.体外用纯化的3型腺病毒、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株与正常健康人血清孵育以检测补体C3a产物。4.BALB/c小鼠鼻内接种3型腺病毒、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株建立腺病毒下呼吸道感染动物模型,每天监测小鼠体重变化,分别在感染后第3、5、7天收集标本。观察腺病毒感染后肺组织匀浆是否出现致细胞病变(Cytopathic effect,CPE)。Q-PCR检测肺组织病毒载量。瑞氏染色后行支气管肺泡灌洗液(Bronchoalvo larlavage fluid,BALF)中炎症细胞及其分类计数。苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)后行肺组织病理评分;酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测BALF中的细胞因子。结果:1.病毒定量结果显示7型腺病毒拷贝数显著高于3型腺病毒(p<0.05);腺病毒生长曲线提示7型腺病毒在感染后24、36、60和72h病毒拷贝数明显高于3型腺病毒和重组腺病毒Ad3/H7株(p<0.05);3型腺病毒与7型腺病毒共培养结果提示在感染后12、24、36、48、72h,HAd V-7病毒复制明显高于HAd V-3(p<0.05)。2.细胞毒性结果显示以低MOI感染A549细胞后,各时间点的细胞活性均无明显差异;以高MOI感染A549细胞后,在感染后2、4h,3型腺病毒细胞活性比7型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株细胞活性分别高26.5、42.6%和33、37.7%(P<0.05,P<0.01)。3.腺病毒激活补体实验结果表明C3a产物增加在2分钟时7型腺病毒与重组腺病毒Ad3/H7株、3型腺病毒有统计学意义。4.肺组织匀浆感染A549细胞后出现了较为明显的CPE。3天时肺组织中7型腺病毒拷贝数明显高于3型腺病毒(p<0.05)。腺病毒感染BALB/c小鼠后引起的炎症细胞类型以巨噬细胞和淋巴细胞为主;肺组织病理损伤以7型腺病毒感染最重,病理评分7型腺病毒较重组腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高(p<0.05);。BALF中细胞因子TNF-a,IL-1β,IL-6和IFN-γ均有升高,以IL-1β升高最为显著,7天最为明显,7型腺病毒较重组腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高明显(p<0.05)。结论:7型腺病毒致病性强于3型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株,提示不同血清型Ad V纤毛蛋白差异可能导致Ad V致病力的差异。第三部分3、7型腺病毒纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合介导其致病性差异的机制研究目的:第二部分研究结果表明3型腺病毒与7型腺病毒具有不同的纤毛蛋白,故具有不同的致病能力,但不同纤毛蛋白导致临床病情轻重不同的具体机制尚不清楚。目前研究已经证实B种腺病毒纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合触发了感染,因此本部分探讨是否3型腺病毒与7型腺病毒的纤毛蛋白与受体CD46、DSG-2结合导致了其后病情发展的不同。方法:1.收集3型腺病毒、7型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株感染A549细胞后0.5、2小时的细胞爬片,通过激光共聚焦显微镜检测病毒与受体结合表达以及水平。2.采用体外转染CD46 si RNA、DSG-2 si RNA,通过Q-PCR法进行转染后3、7型腺病毒定量以及ELISA方法检测转染后IL-8产物。结果:1.激光共聚焦显微镜观察在腺病毒感染的早期,随着时间的延长,7型腺病毒与其受体CD46、DSG-2进入细胞内荧光明显多于3型腺病毒和重组腺病毒Ad3/H7株。2.Q-PCR检测结果表明,分别在使用CD46 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷贝数分别下降了5.8×104、7.9×104、16.6×104以及34.2×104;7型腺病毒拷贝数分别降低了15.2×107、19.6×107、24.8×107以及43.9×107;3型腺病毒与7型腺病毒拷贝数降低幅度为75.3%vs 65.8%;72.5%vs 69.3%;82.2%vs 67.6%;88.1%vs 74.2%;分别在DSG-2 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷贝数分别降低了6.7×104、6.6×104、12.1×104以及21.4×104;7型腺病毒拷贝数分别降低了4.5×107、13.4×107、21.7×107以及33.7×107;3型腺病毒与7型腺病毒拷贝数降低幅度为88.2%vs56.3%;75.9%vs 77.9%;86.4%vs 78.1%;87.7%vs 73.6%;在使用CD46si RNA后6、24h,3型腺病毒诱导的IL-8的分泌量(pg/ml)分别减少了98.8、187.5,7型腺病毒诱导的IL-8的分泌量(pg/ml)分别减少了144.4、366.6,3型腺病毒与7型腺病毒诱导的IL-8的分泌减少幅度分别为75.6%vs 73.7%;82.1%vs 84.3%;在使用DSG-2 si RNA后6、24h,3型腺病毒诱导的IL-8的分泌量(pg/ml)分别减少了69.9、136.5,7型腺病毒诱导的IL-8的分泌量(pg/ml)分别减少了105.2、186.1,3型腺病毒与7型腺病毒诱导的IL-8的分泌减少幅度分别为76.2%vs 77.9%;83.0%vs 83.3%;比较干扰前后7型腺病毒和3型腺病毒IL-8的产物下降量及减少幅度均无统计学差异。结论:病毒与受体结合免疫荧光以及受体基因沉默实验提示不同血清型腺病毒的纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合导致了不同严重程度疾病的潜在机制,这些研究结果为理解不同腺病毒的毒力差异及为将来研制基于纤毛蛋白抗原表位的疫苗及抗腺病毒药物提供了重要的理论依据。