目的 粘多糖(mucopolysaccharide)又称糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，为糖类多聚体，与蛋白质结合成蛋白多糖复合物，是结缔组织的主要成分。它包括透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)、硫酸乙酰肝素(Heparitin sulfate，HS)和硫酸角质素(keratan sulfate，KS)。粘多糖病I型(mucopolysacchridosis typeI，MPS-I)主要是因为患者体内缺乏降解HS、DS的α-L-艾杜糖酶(α-L-iduronidase，IDUA)使其在体内大量堆积，并引起了一系列的临床症状。根据病情可将MPS-I型分为重型(Hurler syndrome，IH)、轻型(Scheie syndrome，IS)和中间型(Hurler／Scheie syndrome，IH／S)。其中MPS-IH型的发病率为1／100，000至1／150，000，居各种MPS之首，被称为标准型MPS，我国也以该型居多。国外相关研究证明：MPS-I型是一种常染色体隐性遗传病，其发病的根本原因是患者的IDUA基因发生了突变。1990年，Scott等将IDUA基因定位于4p16.3，长度为19Kb，含14个外显子。有人提出MPS-I型患者的不同症状是由不同的IDUA突变基因造成的，IH型患者是重型突变基因的纯合子；IS型患者是轻型突变基因的纯合子；而介于它们之间的中间型患者则是重型突变基因和轻型突变基因的杂合子。迄今已发现IDUA基因各种类型的突变达60余种；近几年来我国台北也报道了一些新的突变类型。但是我国内陆地区MPS-I型患者IDUA基因的突变类型尚属未知。目前，我国对该病的研究仍旧停留在酶学诊断水平，这是不够的。因为以往的研究表明：即使是正常人其白细胞中IDUA活性也存在很大差异，而且部分正常人和携带者的酶活性很接近，。这样，在没有先证者的情况下有时很难做出诊断。此外，有研究认为即使是MPS-IS或MPS-IH／S型患者，其白细胞中IDUA的活性也仅达正常值的0.13％，提示虽然 MPSJ型患者的临床症状差别很大，但彼此之间白细胞中IDUA活性的差别并不十分显著。所以仅仅依靠酶学检查，根本无法客观地评价诸如骨髓移植等治疗手段的确切疗效。鉴于此，我们从1999年初便开始从研究我国辽宁地区 MPS一互型患者、携带者及部分正常人白细胞中IDUA的活性入手，逐步深人地探究我国患者IDUA基因的多态性和它的变异情况，与国外的相关研究结果做比较，分析它们的异同，并试图找到我国MPSJ型患者IDUA基因的突变类型与其临床表现之间的关系，为指导优生优育和将来真正意义上的基因治疗提供理论依据。 方 法 1．成色法测定患者及携带者白细胞中a－L一艾杜糖酶的活性： 反应液中加人20ul．olmoUL的苯基一a－L一艾杜糖奇，30d缓冲液N．4moUL甲酸钠，0．15mol／L氯化钠及 0．l％叠氮钠，PH值为 3．5人snunol／L D一葡糖二酸内脂30ul，白细胞匀浆70ul，总体积为 150ul。对照管中不加人苯基一a－L一艾杜糖昔。25 t孵育18h，加人酚试剂250ul，4t，700转／分离心 15分钟，取上清 500＊，加人 12％ N82CO30．76rnl，37℃成色20分钟，使用722分光光度计测定光密度，波长660run，读取吸光度。计算酶活性，以pmol／ h·ms·pro表m。 2．荧光法测定患者及携带者白细胞a－L一艾杜糖酶的活性： 取 0．2。cUL 4一甲基伞形酮一a－L一艾杜糖着（4MU－a－L－idu－ronide）24ul，srnmol／L D一葡糖二酸内脂24ul，白细胞匀浆24ul，混匀，37℃水浴lh。对照管以Titon代替细胞匀浆。用PH值为10的甘氨酸一碳酸钠缓冲液760ul中止反应。使用960型荧光分光光度计，激发波长365urn，发射波长450run测荧光。计算酶活性，以nmoVh．mg．Pro表示。 3．标本采集和基因组DNA的制备： 取EDTA抗凝新鲜血液500ul，饱和盐一氯仿抽提基因组DNA，200倍稀释后，用BECKMAN DU－600分光光度计测定O．D．值，波长为280urn及 ·2·260run，计算DNA的浓度及纯度。 4．PCR扩增 IDUA基因外显子11、皿 ＊、皿、Vlll、IX、XI： 反应总体积为20ul，其中含2 X GC buffer 10ul，dNTP3．Zul，20Pm。l／dl引物各0．sul，LA Taq酶（Takara公司贝．Zul，去离子水6ul及模板DNA lul。PCR扩增使用仪器为 Biometra UNO－11。 5．RFLP并DNA测序法检测患者IDUA基因是否发生了三种常见突变： 外显子IX扩增产物进行酶切，反应体积为20ul，其中DNA扩增产物10ul，限制性内切酶Bfal（为Mael的同工酶，由Biolabs公司生产厂ul0EBI．－－－xri为Zd，去离子水7ul，，充分混匀后，37℃水浴lh。外显子11扩增产物进行酶切的反应体积为20ul，其中DNA产物10ul，限制性内切酶HaPlllul，10 x buffer Zul，去离子水7iii，充分混匀，37t水浴 lh。测序使用仪器为IBM PRISM 377。 6．SSCP并DNA测序法检测患者IDUA基因是否存在新的突变类型： 取上述扩增产物各 5 ul，加人 lx loading buffer25 l，混匀，离心，97 t－98T变性15m，冰浴10m，上样3ul，电泳6．sh，压片，静置于一70t冰箱中48h，洗片?