【摘 要】
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目的:1.构建DBM-明胶的核壳结构微组织,在体外评价其力学仿生性能和促BMSCs成骨诱导活性;2.建立大鼠皮下异位成骨模型和原位颅骨缺损模型,评价核壳结构微组织的体内骨缺损修复再生能力;3.建立一种磁控结构化液滴技术,通过磁矩编程和液滴焊接实现骨组织工程微组织的精细操控及组装。方法:1.在体外利用微阵列芯片制备DBM-明胶的核壳结构微凝胶,通过光镜和SEM表征其大体结构,并测量其弹性模量、BMP
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目的:1.构建DBM-明胶的核壳结构微组织,在体外评价其力学仿生性能和促BMSCs成骨诱导活性;2.建立大鼠皮下异位成骨模型和原位颅骨缺损模型,评价核壳结构微组织的体内骨缺损修复再生能力;3.建立一种磁控结构化液滴技术,通过磁矩编程和液滴焊接实现骨组织工程微组织的精细操控及组装。方法:1.在体外利用微阵列芯片制备DBM-明胶的核壳结构微凝胶,通过光镜和SEM表征其大体结构,并测量其弹性模量、BMP-2缓释效率、细胞接种率,初步验证核壳结构微凝胶的力学仿生性能。随后接种BMSCs于核壳结构微凝胶,并置入生物反应器一体化扩增诱导制备核壳结构微组织,接种后于相应时间点通过活死细胞染色、MTT、ds DNA定量等方法检测微组织上细胞活性;更换成骨诱导液以后,通过测量成骨相关基因的表达、Von Kossa染色等方法检测微组织的成骨诱导能力。2.选取SD大鼠作为实验对象,首先构建大鼠背部皮下异位成骨模型,并植入核壳结构微组织,1个月后取材,通过micro-CT评估新生骨量和骨密度,通过H＆E和CD31分析其新生骨组织量及新生血管数量。随后构建大鼠临界颅骨缺损模型,并植入核壳结构微组织,分别于1月和3月取材,通过Micro-CT分析其原位新生骨量,通过H＆E、Masson、Col-1、OCN组织学分析其原位新生骨组织量。3.利用海藻酸钠和POSS-NH2在水-油交界面的电荷互补作用形成结构化液滴,通过模具塑形,通过磁滞回线测量液滴磁学特性,通过流变测试检验液滴铁磁性与溶液粘弹性之间的关系。通过磁化和重新磁化的方式控制液滴运动,并在液滴连接处高温处理焊接液滴,通过紫外光照使Gelma交联成凝胶,并加入Ca Cl2使海藻酸钠化学交联,最终完成微组织的组装。结果:1.光镜和SEM下观察到明显的核壳结构,核壳结构微凝胶的弹性模量（2.7±1.2 MPa）比单纯明胶微凝胶（1±0.3 Mpa）高,在26天内核壳结构微凝胶能实现BMP-2的持续释放（累计释放量达175 pg/10μL）。相比于单纯明胶微组织,活/死细胞染色和SEM显示核壳结构微组织上细胞存活的更好,且细胞外基质分泌更多。体外培养7 d,MTT（OD值:核壳组:1.8±0.5;明胶组:1.4±0.1）和ds DNA定量（ds DNA含量:核壳组:36±0.2 ng/mg;明胶组:24±0.1 ng/mg）的结果显示核壳结构微组织上细胞活性更好。成骨诱导21 d,Von Kossa和钙定量（钙含量:核壳组0.62 mol/L,明胶组0.21mol/L）的结果表明核壳结构微组织上累积更多矿化结节。2.植入大鼠背部异位成骨模型4周后,micro-CT（骨量:核壳组:1.2±0.4 mm~3;明胶组:0.25±0.15 mm~3）和组织学的结果表明核壳结构微组织新生骨组织量更多,CD31免疫组化（微血管数:核壳组:62±5个/视野;明胶组:35±3个/视野）的结果表明核壳结构微组织新生血管数量更多。对大鼠原位颅骨缺损修复12周后,micro-CT（骨量:核壳组:2.8±0.5 mm~3;明胶组:1.5±0.2mm~3）和组织学（H＆E,Masson,Col-1和OCN）的结果表明核壳结构微组织对原位临界颅骨缺损的修复效果更好。3.由10%Gelma、1%海藻酸钠和2.5 mg/ml纳米氧化铁组成的预混液具备铁磁性（Mr/Ms:0.172,矫顽力Hc:5.978 k A/m）,单个及多个液滴均可被外磁场（20 m T）磁化,磁化后施加更强的磁场（23 m T）可使液滴重新磁化。通过磁化及重新磁化可实现混合BMSCs液滴的磁矩编程,焊接液滴,交联,完成骨组织工程微组织精细操控及组装。结论:1.核壳结构微组织具有良好的力学和骨诱导活性双仿生性能。DBM微颗粒作为内核,可以为微组织提供良好的力学支撑,其上负载的BMP-2可促进微组织的成骨诱导活性。相比于单纯明胶微组织,核壳结构微组织上BMSCs增殖活性更好,且细胞成骨效果更好。2.核壳结构微组织能在大鼠背部皮下异位成骨,且能促进大鼠原位临界颅骨缺损的修复。这可能与DBM微颗粒提供的良好力学支撑和骨诱导活性相关;此外,具有开放式多孔结构的明胶壳层也可以BMSCs提供保护,使BMSCs在体内更好的发挥修复作用。3.通过磁化和重新磁化的方式可以利用外磁场操控液滴的运动和移动,在此基础上可通过磁矩编程实现骨组织工程微组织的多级组装。这种基于磁控结构化液滴的微组织组装方式不仅可以精细设计组装的每个步骤,也可以实现不同种类微组织的组装。
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