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研究背景随着环境污染加重,人口老龄化加剧,中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)疾病发病率日渐上升,严重危害人类健康。这些CNS疾病的临床治疗都面临一个共同的瓶颈——血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)。BBB主要由内皮细胞间紧密连接(Tight Junction,TJ)构成,对循环血液中的物质具有严格选择透过机制,从而保证CNS的正常功能。然而BBB在阻止异物入侵脑组织的同时,也阻止了大部分治疗药物进入脑病变区域。如何安全有效地开放BBB,一直是研究者关注的焦点。本实验室前期研究发现,电磁辐射(Electromagnetic Radiation,EMR),尤其是电磁脉冲(Electromagnetic Pulse,EMP),可导致BBB通透性的可逆性增加。但EMP诱导BBB通透性增加的最佳物理参数尚不清楚。此外,其他参数EMR是否也具有该效应?其效应规律如何?亦不清楚。为解决上述问题,本研究以SD大鼠为实验对象,研究了不同参数EMR,如EMP、超宽谱电磁脉冲(Ultra-Wide Band Electromagnetic Pulse,UWB-EMP)和射频辐射(Radiofrequency Radiation,RFR)对BBB通透性的影响。研究目的探讨不同参数EMR(EMP、UWB-EMP、RFR)对BBB通透性的影响,为EMR开放BBB的临床应用提供初步理论和实验依据。第一部分EMP对BBB通透性的影响材料与方法1辐照源:SPG200-EMP辐照源,辐照腔内为均匀的电磁场,场强350k V/m。脉宽可调为50ns或7ns。脉冲次数可设置为0~6000次。重复频率1Hz。2动物分组及辐照参数:健康成年雄性SD大鼠108只,随机分为辐照组(84只)和假辐照组(24只)。辐照参数具体如下:2.1不同脉冲次数EMP对BBB通透性影响:场强350k V/m、脉宽50ns,脉冲次数分别为100、200、400、800、1600次,于全身辐照后3h取材。2.2不同脉宽EMP对BBB通透性影响:场强350k V/m、脉冲次数200次,脉宽分别为7、50ns,于全身辐照后3h取材。3检测方法:以内源性白蛋白和外源性伊文思蓝(Evans Blue,EB)为血管通透性示踪剂,分别应用免疫组化和EB荧光显微镜观察等方法检测辐照后BBB通透性。研究结果1不同脉冲次数EMP对BBB通透性的影响:场强为350k V/m、脉宽为50ns时,经脉冲次数为100、200、400、800、1600次EMP辐照后3h,大鼠脑额叶皮层部分微血管周围出现不同程度白蛋白免疫阳性产物(P<0.05);其中200次EMP辐照后,周边出现免疫阳性染色的血管数最多、阳性范围最大,100和400次辐照组次之,800和1600次EMP辐照组则与假辐照组相比无统计学差异(P>0.05)。EB荧光结果与白蛋白免疫组化结果基本一致。说明:200次EMP辐照后,BBB通透性增加最明显;脉冲次数超过400次后,EMP可能未引起明显的通透性增加。2不同脉宽EMP对BBB通透性的影响:场强为350k V/m,脉冲次数为200次时,经脉宽7ns或50ns的EMP辐照后3h,大鼠脑额叶皮层部分微血管周围出现白蛋白免疫阳性产物(P<0.05),呈散在分布;脉宽为50ns时,白蛋白免疫阳性范围更大。说明随着脉宽的增宽,BBB通透性逐渐增加。EB荧光显色结果则显示,在该辐照条件下,仅脉宽为50ns时,BBB通透性显著增加(P<0.05)。第二部分UWB-EMP对BBB通透性的影响材料与方法1辐照源:UWB-EMP辐照源,由脉冲发生器和喇叭天线构成。距离喇叭口不同位置处场强不同,据此可选择辐照场强。脉宽不可调,在1ns之内。脉冲次数可根据实验需要设置。重复频率10Hz。2动物分组及辐照参数:成年雄性SD大鼠180只,随机分为辐照组(132只)、阳性对照组(12只)和假辐照组(36只)。辐照组具体参数如下:2.1不同场强UWB-EMP对BBB通透性影响:脉冲次数20000次,场强分为50、200、400k V/m,全身辐照后3h取材;2.2 UWB-EMP对BBB通透性影响的时效规律:场强400k V/m、脉冲次数20000次,全身辐照,根据辐照后取材时间分为0.5、3、6、24h组。3检测方法:以内源性白蛋白、血清S100β蛋白和外源性EB为血管通透性示踪剂,分别采用免疫组化、酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)和EB荧光显微镜观察法检测辐照后BBB通透性;采用免疫印迹法(Western Blotting,WB)、免疫荧光染色法分析TJ相关蛋白ZO-1的表达水平和分布。研究结果1不同场强UWB-EMP对BBB通透性的影响:脉冲次数20000次时,经场强为50、200、400k V/m的UWB-EMP辐照后3h,大鼠脑额叶皮层出现散在分布的白蛋白免疫阳性染色;场强为400k V/m时,白蛋白渗出最多(P<0.001),其他组与假辐照组相比无统计学差异。EB荧光结果与白蛋白免疫组化染色结果一致。说明脉冲次数为20000次、场强为400k V/m时,UWB-EMP可显著增加BBB通透性。2 UWB-EMP对BBB通透性影响的时效规律:场强为400k V/m、脉冲次数为20000次时,UWB-EMP辐照后0.5h,大鼠脑额叶皮层白蛋白渗出开始增多;辐照后3h—6h白蛋白渗出最多(P<0.05);辐照后24h组,白蛋白染色结果与假辐照组基本相同(P>0.05)。EB荧光结果与白蛋白免疫组化染色结果一致。血清S100β蛋白ELISA检测结果显示,UWB-EMP辐照后6h血清S100β含量显著增多(P<0.05)。以上结果说明:UWB-EMP辐照后0.5h,BBB通透性即开始增加,于辐照后3-6h之间达到最大,辐照后24h基本恢复正常。3 UWB-EMP辐照后,TJ相关蛋白Zonula Occludens 1(ZO-1)检测结果:400k V/m、20000次UWB-EMP辐照大鼠后,WB法检测发现,辐照后3h和6h脑额叶皮层ZO-1蛋白水平明显降低(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,辐照后3h,ZO-1免疫荧光强度减弱,而分布方式依然为连续性分布,各组ZO-1蛋白分布无明显差异(P>0.05)。以上结果提示UWB-EMP可能通过降低ZO-1的表达暂时、可逆地增加BBB通透性。第三部分RFR对BBB通透性的影响材料与方法1辐照源:RFR辐照源,频率1840MHz,输出功率可调,辐照时间可调。2动物分组及辐照参数:健康成年雄性SD大鼠36只,随机分为辐照组(18只)和假辐照组(18只)。辐照参数:频率1840MHz,比吸收率(Specific Absorption Rate,SAR)2W/kg,每天辐照1h,连续辐照7d,辐照结束后即刻取材。3检测方法:以内源性白蛋白和外源性硝酸镧为血管通透性示踪剂,分别采用免疫组化和透射电镜法观察辐照后BBB通透性;采用WB分析TJ相关蛋白ZO-1表达水平。研究结果经1840MHz、2W/kg RFR连续辐照7d后,大鼠脑额叶皮层白蛋白免疫阳性染色明显增多。硝酸镧示踪法显示,辐照后大鼠脑皮层部分微血管基底膜处有镧颗粒沉积,周围脑实质内有少量镧颗粒渗入。WB法检测ZO-1表达水平发现,RFR辐照后ZO-1表达水平明显下降(P<0.001),提示TJ损伤可能是RFR辐照后大鼠BBB通透性改变的原因之一。研究结论1当场强350k V/m、脉宽50ns、脉冲次数200次时,EMP诱导BBB开放的效应最明显。2当场强400k V/m、脉冲次数20000次时,UWB-EMP致BBB开放效应最明显,且为短暂、可逆的开放;UWB-EMP可能通过降低ZO-1表达,诱导BBB通透性改变。3经1840MHz、2W/kg的RFR连续辐照7d(1h/d),大鼠额叶皮层BBB通透性明显增加,且ZO-1表达水平的降低可能在该过程中发挥重要作用。4本研究发现EMP诱导BBB开放的效应没有随脉冲次数的增加而更明显,该规律尚需大量实验验证,其中的机制也需要进一步研究。