研究背景与目的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是严重危害人类生存和生活质量的一类中枢性神经创伤。随着全民运动的日益普及和越来越频繁的交通运输活动,脊髓损伤的发生率近年来有了显著的增高。研究表明,脊髓损伤后微循环障碍导致的脊髓缺血-水肿-自由基变化-水肿-缺血加重的恶性循环是造成脊髓神经组织不可逆的变性、坏死和细胞凋亡的主要过程之一。在这一过程中,血-脊髓屏障(blood spinal cord barrier, BSCB)功能缺失导致的血管渗透性增加是该恶性循环中的关键事件。本研究定性定量评估SCI前后脊髓血管内皮细胞间紧密连接的超微结构变化和紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1以及新生血管的空间分布和表达,探讨紧密连接与血管发生在脊髓损伤后BSCB功能改变中的作用和相关机制。方法1.80只SD大鼠用于本实验。20只SD大鼠作为正常组,60只SD大鼠利用改良Allen’s打击方法构建脊髓损伤模型后,随机分为损伤后1天组,3天组,7天组,每组20只。获取正常组和上述各时间点胸10(T10)段脊髓组织用于以下检测。2.利用透射电子显微镜观察正常与脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓微血管紧密连接超微结构。各时间点样品数4只,共16只。3.利用组织免疫荧光技术和Western Blotting技术,对正常与脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1的空间分布与表达进行定性定量评估。蛋白荧光分析采用ImagePro Plus软件。各时间点样品数4只,共32只,其中16只用于组织免疫荧光分析,余16只用于Western Blotting分析。4.利用组织免疫荧光技术,对正常与脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠血管发生标记CD34+细胞的空间分布与表达进行2D评估。蛋白荧光分析采用ImagePro Plus软件。各时间点样品数4只,共16只。CD34分别与紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1荧光共标记。5.通过活体注射EB染料,在荧光显微镜下观察正常与脊髓损伤后1天、3天、7天BSCB渗透性变化,定性分析正常组及脊髓损伤后各时间点BSCB功能。同时借助分光光度仪检测脊髓组织中EB含量,定量评估正常组及脊髓损伤后1天、3天、7天BSCB功能。各时间点样品数4只,共32只,其中16只用于定性分析,余16只用于定量评估。6.以上实验数据统计均采用SPSS13.0软件,组间比较使用T检验,P<0.05具有统计学差异。结果1.紧密连接透射电镜观察证实,正常组大鼠脊髓血管内皮细胞间紧密连接呈铆钉状结构,构成相对封闭的血管管腔。在急性脊髓损伤后,细胞间紧密连接开放,在3天时细胞间隙增宽最为显著,之后随时间延续逐渐恢复,但在7天时仍未达到正常水平。2.紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1组织免疫荧光结果发现,在正常组脊髓,紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1均与血管分布呈现高度一致性。在SCI后1天、3天、7天,上述蛋白均出现分布异常与不同程度的表达下降。其中在损伤后1天最为显著,之后随损伤时间延续逐渐恢复,但在SCI后7天,仍未恢复正常水平。Western Blotting结果同样发现,在SCI后1天,Claudin-5、ZO-1蛋白较正常组显著下降,并在SCI后3天、7天逐渐恢复,但7天时仍未达到正常水平。3. CD34+细胞分布与表达组织免疫荧光结果发现,在正常组脊髓,CD34+细胞分布于血管内皮。在SCI后,CD34+细胞在损伤中心区域分布缺失,同时出现不同程度表达下降,在脊髓损伤后1天最为显著,之后随损伤时间延续逐渐恢复,但在SCI后7天时仍未恢复正常水平。在脊髓损伤后3天,损伤中心区域出现少量CD34+细胞。在损伤后7天,损伤中心区域可见大量CD34+细胞表达。4. BSCB渗透性正常大鼠脊髓几乎无法观察到EB的渗出。在脊髓损伤后1、3、7天,出现了不同程度的EB渗出,其中损伤后3天时EB的渗出最为显著。定量结果显示脊髓损伤后1天即出现了组织EB含量的增加,在损伤后3天,组织EB含量最多,与定性观察结果一致。结论1.大鼠脊髓损伤后脊髓血管内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5、Z0-1出现分布异常与表达下降,在损伤后1天最为显著,之后逐渐恢复。2.大鼠脊髓损伤后脊髓血管网络被破坏,在损伤后1天最为显著；在损伤后3天出现损伤中心区域血管发生。3.大鼠脊髓损伤后BSCB功能改变可能与紧密连接开放、紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1表达下降、血管发生有关。