论文部分内容阅读
前言子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种妊娠期特有疾病,其主要临床表现为妊娠20周后出现高血压、蛋白尿,甚至合并全身其他相关脏器损伤,严重影响孕产妇和围产儿健康,危及母儿安全。该病发病率居高不下,在低收入发展中国家显著增多。至今具体机制不明,相关学说众多,如遗传因素及营养缺乏、炎症免疫过度激活、滋养细胞浸润功能不足、血管内皮细胞受损、胰岛素抵抗等。其中滋养细胞浸润功能不足所致的子宫螺旋动脉重铸障碍与滋养细胞的行为改变密切相关。深入研究滋养细胞的生物学功能,同时探究影响其行为因素,进而预防疾病的发生发展,降低围产期疾病的发病率。Hippo信号通路最早在果蝇中发现,该信号通路高度保守;近些年来研究表明,Hippo通路广泛存在于哺乳动物中,通过控制细胞增殖与凋亡以维持组织动态平衡,是胚胎发育与肿瘤形成的重要通路。当抑制Hippo信号通路后可导致肿瘤细胞过度生长和肿瘤发生。因此Hippo通路可作为肿瘤抑制途径和治疗干预的潜在节点。YAP(Yes associated protein,YAP)作为转录共激活因子在Hippo信号通路中发挥核心组件作用。Hippo通路主要调节机制为逐级磷酸化激活过程,YAP的功能发挥主要取决于细胞定位,非磷酸化的YAP可作为致癌基因进入到细胞核和其他因子结合启动相关基因转录,进而促进肿瘤形成。YAP基因与肿瘤干细胞维持、上皮间质转化(Epithelial.mesenchymal transition,EMT)、侵袭及化疗耐药等肿瘤相关生物学行为密切相关。滋养细胞参与胚胎着床及胎盘形成,其过程中发挥了类肿瘤细胞作用,但目前对YAP如何调控滋养细胞分化、参与滋养细胞着床等相关机制还不明确。本实验将明确YAP在胎盘组织中的表达位置,分析YAP是否参与子痫前期发病,并深入探讨YAP基因是否参与滋养细胞浸润、凋亡、增殖等相关过程;我们还将进一步分析YAP是否通过调节下游因子进而影响滋养细胞的功能,这将为子痫前期,胎儿宫内生长受限等围产期疾病向YAP的靶向治疗提供理论依据。方法第一部分:YAP在胎盘组织中的表达情况收集30例早孕绒毛组织(孕早期胎盘),30例足月胎盘组织,30例子痫前期胎盘组织,早孕妊娠组与孕足月妊娠组,孕妇体健(无任何流产倾向),这些孕妇无感染,未接受抗生素治疗,及未合并妊娠期相关疾病。应用qRT-PCR法,Western Bolt检测YAP在早孕期,孕足月胎盘及子痫前期胎盘组织中表达差异。采用免疫组化方法,检测YAP在胎盘组织中的表达部位。第二部分:YAP对滋养细胞浸润、凋亡、增殖生物学功能的影响及机制体外培养HTR-8/SVneo滋养细胞,转染YAP高表达的质粒和YAP siRNA进入HTR-8/SVneo细胞。利用qRT-PCR和Western Blot检测转染后mRNA及蛋白表达水平。Transwell法观察HTR-8/SVneo浸润能力情况,流式细胞术检测HTR-8/SVneo的凋亡能力情况,CCK-8法检测HTR-8/SVneo增殖能力。通过qRT-PCR和Western Blot检测YAP下游分子CDX2的mRNA及蛋白质表达水平,进一步研究Hippo-YAP通过CDX2影响滋养细胞生物学功能。结果第一部分:我们利用qRT-PCR和Western Blot方法在早孕绒毛组织,孕足月胎盘组织及子痫前期胎盘组织中检测YAP mRNA及蛋白质的表达含量。结果表明在子痫前期胎盘组织中YAP mRNA和蛋白水平均降低,在早孕绒毛组织中YAP mRNA和蛋白水平表达增高。我们运用免疫组织化学技术进一步确定YAP在胎盘组织中的表达部位,发现YAP表达于合体滋养细胞,YAP在子痫前期胎盘组织中表达含量相对较低。此结果提示YAP极有可能参与滋养细胞生物学行为,从而引起子痫前期的发病。第二部分:我们应用转染技术构建YAP过表达/沉默表达体系,以进一步研究滋养细胞生物学功能,分别转染pc DNA3.1-YAP质粒和Si-YAP小干扰RNA进入HTR-8/SVneo细胞时,YAP可以有效的上调表达和下调表达,而空载体组和无序的siRNA组与空白组差异无统计学意义。我们应用Transwell检测滋养细胞的浸润能力,结果提示过表达组与对照组细胞数分别为201.5±4.272,104.8±2.689,si-YAP与对照组细胞数分别为48.50±1.323,96.50±2.500,(P<0.01,差异具有统计学意义)。YAP蛋白可促进HTR-8/SVneo细胞的浸润能力。我们采用流式细胞术分析细胞的凋亡能力,结果提示:过表达与对照组细胞凋亡率分别为13.48±0.4193,23.61±0.7363,si-YAP与对照组细胞凋亡率分别为36.40±0.6616,25.95±0.9233,(P<0.01,差异具有统计学意义)。综上,YAP蛋白可抑制HTR-8/SVneo细胞的凋亡功能。我们采用CCK-8实验检测HTR-8/SVneo细胞的增殖功能,分别在种板后24h,48h,72h对细胞增殖功能进行检测,证实上调/下调YAP对滋养细胞增殖功能无明显影响。利用qRT-PCR和Western Blot检测上调/下调YAP后CDX2的mRNA和蛋白质水平表达情况。结果显示:上调YAP的表达后,可以显著提高CDX2 mRNA及蛋白质的表达水平,下调YAP的表达后,可以显著降低CDX2 mRNA及蛋白质的表达水平。因此我们推测YAP极有可能通过CDX2影响滋养细胞浸润和凋亡,参与子痫前期的发病。结论1.YAP mRNA和蛋白水平在子痫前期胎盘组织中显著降低,YAP极有可能参与子痫前期的发病。2.YAP参与滋养细胞的生物学行为。3.YAP对增强滋养细胞HTR-8/SVneo的浸润能力,抑制滋养细胞HTR-8/SVneo的凋亡,对其增殖能力没有影响。4.YAP极有可能通过CDX2影响滋养细胞浸润和凋亡,参与子痫前期的发病。