论文部分内容阅读
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(Foot-and mouth disease virus, FMDV)引起的传染病,疫情传播迅速,是全球共同面临的防控难题,疫苗免疫是其最重要的技术手段。然而,由于FMDV自然属性限制,导致疫苗种毒生产性能不好、免疫抑制严重、体液免疫应答晚、细胞免疫应答不强、免疫持续期短、型间交叉不保护等一系列问题,制约了口蹄疫常规疫苗的发展及其效力的提升,影响疫苗的田间应用效果。设计和构建生产性能优良、抗原谱广、免疫原性强的疫苗种毒是提升疫苗效力的关键技术手段。我们前期研究制备了生产性能高、抗原稳定和免疫效力高的疫苗种毒(),而且实现了在VPl中插入HIS和FLAG标签的种毒毒株(),为本研究奠定了基础。在本研究中,我们利用反向遗传操作技术,在Asial型口蹄疫病毒拯救系统上,在VP1的受体结合位点+9位后引入O型B细胞表位,之后,通过柔性Linker引入单个口蹄疫病毒3A上的T细胞表位或与麻疹病毒融合蛋白上的T细胞表位联合引入。将构建成功的重组毒质粒分别在BHK-21细胞系上转染能够出现细胞病变(CPE)。连续传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光等实验鉴定,成功拯救了插入0型B细胞表位和外源T细胞表位的两株重组病毒,命名为rAsia Ⅰ-OM3A、rAsia Ⅰ-03A。比较测定了重组毒rAsia Ⅰ-OM3A、rAsia Ⅰ-03A与亲本毒的生物学特性,结果显示：在BHK21细胞上,重组毒rAsia Ⅰ-OM3A的TCID50为10-,rAsia Ⅰ-03A的TCID50为10-8.0,亲本毒rAsia I的TCID5.为10-8·33说明插入0型B细胞表位和两个T细胞表位的重组毒与亲本毒相比毒力变弱。在乳鼠上测定不同毒株的致病性,显示,重组毒rAsia Ⅰ-OM3A的LD50为10-6,rAsia Ⅰ-O3A的LD50为10-6.5,亲本毒的LD50为10-7.33说明重组毒rAsia Ⅰ-OM3A与亲本毒相比对乳鼠的致病力也变弱。将两株重组毒与亲本毒株rAsia Ⅰ在易感动物猪上做致病性试验。结果表明：两组重组毒rAsia Ⅰ-OM3A和rAsia Ⅰ-O3A毒株,攻毒组均未出现口蹄疫临床症状,而亲本毒(rAsia I)毒株攻毒组五头猪中有三头都出现典型的口蹄疫临床症状。两株重组毒攻毒组均未出现血毒症和感染抗体；而亲本毒毒株攻毒组有血毒症和感染抗体。这表明口蹄疫插入上述三个基因后使得病毒对猪的致病性减弱。两株重组毒与亲本毒分别制备灭活疫苗,在本体动物猪体进行免疫保护试验。用流式细胞仪检测免疫后猪的外周血中CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+T细胞细胞亚群百分含量的变化,能够诱导机体产生早期的细胞免疫应答,用液相阻断检测结构蛋白抗体。之后使用口蹄疫病毒进行攻毒,Asia Ⅰ型病毒攻毒组全部保护,0型毒攻毒组只有重组毒rAsia Ⅰ-OM3A表现了明显的保护作用。由以上数据可知,重组毒rAsia Ⅰ-OM3A的毒力减弱并且对猪的致病力降低,制成疫苗免疫动物产生的免疫应答具有广谱性,同时能对0型口蹄疫病毒有保护作用,可以作为疫苗候选株使用。