甾体激素类药物是临床上一类重要的药物,常用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、心血管、抗肿瘤等疾病。甾体类药物孕二烯酮是新一代强效避孕药的主要成分之一,而15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体。目前工业上主要采用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)在左旋乙基甾烯双酮的C15位上特异引入羟基,但现有的工业生产工艺投料量偏低,从而限制了 C15α的转化效率。已有的研究表明参与雷斯青霉C15α甾体羟化反应的酶属于P450酶系,但编码该C15α羟化酶的基因尚不清楚,因此无法利用基因工程手段对生产菌种进行定向遗传改造。为了克隆和鉴定雷斯青霉的C15α羟化酶基因,本文开展了以下研究工作:(1)考察了雷斯青霉生产菌种C15α羟化活性在转录水平上受左旋乙基甾烯双酮的诱导;(2)根据该菌种转录组测序的基因表达信息,从预测的61个P450基因中选出15个候选C15α羟化酶CYP基因,利用qRT-PCR定量扩增考察了在甾体底物诱导与非诱导条件下候选基因的表达差异情况,最终确定了 12820和6138两个基因受甾体底物的高度诱导;(3)利用本课题组已建立的甾体羟化酶基因酵母功能筛选平台,构建了12820和6138基因的酿酒酵母表达载体和12820基因的毕赤酵母表达载体,获得了相应基因的酿酒酵母和毕赤酵母重组菌株;(4)甾体转化试验表明6138基因重组酵母菌对左旋乙基甾烯双酮没有转化活性,而12820基因的重组酿酒酵母菌株和重组毕赤酵母都能够转化底物左旋乙基甾烯双酮,生成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮,这一结果表明12820为15α羟化酶基因,命名为PRH,该基因全长1865bp,包括5个内含子和6个外显子,开放阅读框长度为1563bp,预测编码520个氨基酸;(5)为了确定雷斯青霉菌种中是否存在其它C15α羟化酶基因,构建了 12820基因的定向敲除载体并探索建立雷斯青霉原生质体转化方法。雷斯青霉左旋乙基甾烯双酮C15α羟化酶基因的克隆和初步鉴定为阐述该酶的羟化反应分子机制奠定了良好基础,同时也为构建下一代高效甾体C15α羟化工程菌株提供了关键的基因资源。