斑蝥素对多种害虫具有较好的毒杀活性,且对多种杀虫剂具有增效作用。小菜蛾(Plutella xylostella)是全世界广泛分布、严重危害十字花科作物的害虫,抗药性发展迅速。斑蝥素及类似物对小菜蛾幼虫的毒杀活性早有报道,但其毒杀作用机理一直不清楚。本文研究了斑蝥素对小菜蛾丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PSPs)的抑制作用,阐述了斑蝥素对小菜蛾毒杀作用机理;检测了小菜蛾体内重要解毒代酶系谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和细胞色素P450单加氧酶(P450s),以及小分子量热激蛋白(sHSP)在斑蝥素侵害后转录水平变化,初步分析了小菜蛾对斑蝥素潜在抗性机制。主要研究结果如下:1.斑蝥素抑制小菜蛾PSPs酶活活性将LC10,LC25和LC50剂量斑蝥素饲喂小菜蛾4龄幼虫,检测到处理试虫体内PSPs活性随处理时间延长或斑蝥素剂量增加均呈逐渐下降趋势。其中LC5。剂量斑蝥素处理48 h的试虫体内PSPs活性仅为对照组的36.96%。斑蝥素在1 nM-100 μM浓度范围内均可抑制小菜蛾PSPs体外活性,经计算IC50值为5.39 μM。2.斑蝥素影响小菜蛾PSPs基因转录水平克隆获得了 6条小菜蛾PSPs基因,PP1、PP2A、PP2B、PP4、PP5和PP6。序列分析比对发现PSPs基因在真核生物类群里高度保守。小菜蛾6条PSPs基因的催化活性域在结构上也高度保守。表达分析发现6条PSPs基因在不同发育时期和不同组织内均表达,除PP6外其余5条基因在成虫期的表达量高于其他龄期的表达量,6条基因均在头部高表达。实时定量PCR检测发现LC10,LC50和LC75剂量斑蝥素均未对小菜蛾PSPs基因的转录水平产生显著影响。3.斑蝥素及其类似物抑制重组表达PSPs蛋白活性利用大肠杆菌表达系统尝试对小菜蛾PSPs基因进行异源表达,发现仅PP2B和PP5可溶表达。利用pNPP作为反应底物对纯化后的重组PP2B和PP5进行活性检测发现,重组PP2B无明显活性,重组PP5具有显著活性,且具有可被花生四烯酸激活的PP5蛋白典型特征。检测了斑蝥素及11种类似物对重组PP5的体外抑制活性,结果显示斑蝥素的抑制活性最强,IC50值为0.38 μM。11种类似物对重组PP5蛋白的IC50值在7.42-538.38 μM之间。各化合物的IC50值与前期生测实验获得的对小菜蛾3龄幼虫的LC50值存在很高的相关性,相关系数R2高达0.87。斑蝥素存在条件下重组PP5酶对底物pNPP的Km值显著增大而Vmax值不变,说明斑蝥素是作用于重组PP5活性口袋的竞争性抑制剂。4.斑蝥素抑制部分小菜蛾GSTs基因表达,并抑制部分重组GSTs蛋白活性从小菜蛾转录组数据库(KONGAbase)获得了 19条GSTs基因。17条可被归入已知的6个不同昆虫GSTs家族,2条暂时无法归类。LC50剂量斑蝥素会显著抑制绝大多数GSTs基因在不同时间点的表达,其中GSTe4和GSTu2在48 h时的表达量分别降低了 12.78倍和11.52倍。纯化获得了 12条GSTs基因在大肠杆菌内的重组蛋白,其中9种重组蛋白具有CDNB结合活性。进一步检测发现,斑蝥素可显著抑制3种重组蛋白GSTe3、GSTo2和GSTu2活性。5.斑蝥素诱导部分小菜蛾P450s的CYP6家族基因过表达从KONGAbase获得了 14条CYP6家族基因。LC50剂量斑蝥素处理后的6-48 h内,1条CYP6基因在各时间点均上调表达,9条CYP6基因的转录水平变化趋势为先降低后升高,1条CYP6基因的转录水平变化趋势为先升高后降低,其余3条CYP6基因的转录水平变化不大。6.斑蝥素诱导部分小菜蛾sHSP基因过表达从KONGAbase获得了 14条sHSP家族基因。LC50剂量斑蝥素处理后仅sHSP22.1表达量呈逐渐升高趋势,在6-48 h的表达量分别为对照组的3.7倍、9.73倍、11.21倍和16.31倍。而sHSP19.5和sHSP20.1在各时间点的表达量均显著降低,其余sHSP基因表达量变化不是非常显著。综上所述,斑蝥素抑制小菜蛾PSPs体内和体外活性,并且斑蝥素竞争性抑制重组小菜蛾PSPs蛋白活性,同时斑蝥素及类似物对重组小菜蛾PSPs蛋白的抑制活性与杀虫活性之间很高的相关性,因此我们认为斑蝥素对小菜蛾的毒杀作用机理是斑蝥素进入小菜蛾PSPs活性口袋,抑制PSPs活性,造成生理活动紊乱而导致虫体死亡。这是一种完全不同于现有杀虫剂的作用机理。另外,斑蝥素可抑制部分GSTs基因的表达或酶活活性可能与其对某些杀虫剂的增效作用有关。部分CYP6家族基因和sHSP基因的表达量在斑蝥素处理后显著升高的发现也为后续深入研究小菜蛾对斑蝥素的潜在抗性机制提供了一定的基础。