研究背景铬及其化合物已成为严重威胁人类健康的不可忽视的环境污染物,广泛应用于工业生产过程如冶金、电镀等。铬的职业暴露可引发的健康危害包括接触性皮炎、鼻中隔穿孔以及支气管癌等。Cr(Ⅵ)可引发急慢性肝炎以及肝损伤。Cr(Ⅵ)最主要的细胞毒作用是诱导凋亡的发生,虽然已有大量的研究证实ROS在Cr(Ⅵ)诱导的细胞毒性中发挥极为重要的作用,但Cr(Ⅵ)具体的作用机制仍不十分清楚,比如ROS如何产生的,Cr(Ⅵ)如何诱导p53、NF-kB的激活等等。本研究除了阐明Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡的作用机制外,也对其诱导肝细胞发生早衰进行了探讨。细胞早衰是近年来的研究热点,是-种不同于凋亡的细胞毒性结局。环境中Cr(Ⅵ)的人群暴露多为低剂量长期的暴露,故研究早衰具有极其重要的实际意义。早衰被认为是抑制细胞恶性转化的一道有力屏障,而凋亡是细胞的程序性死亡,故本研究对Cr(Ⅵ)诱导早衰与凋亡的同时探讨将对阐明Cr(Ⅵ)的致癌机制提供一定的实验依据。研究方法1.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡首先用MTT法检测不同浓度的Cr(Ⅵ)(0-512μM)对L-02肝细胞存活率的影响,选取适宜的浓度(存活率>70%)进行后续试验。DNA-Ladder法检测Cr(Ⅵ)暴露后DNA的损伤；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)法对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,反应细胞凋亡；Annexin V-FITC/PI双染法借助流式细胞仪检测Cr(Ⅵ)暴露后的早期和晚期凋亡细胞；用western blotting法检测不同浓度的Cr(Ⅵ)处理后对PARP、 Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平的影响,进而分析细胞凋亡通路；比色法检测Cr(Ⅵ)对Caspase-3活性的影响；通过对热休克蛋白HSP70与HSP90表达水平的分析研究HSP与caspase-3的关系；通过检测GSH、MDA以及SOD研究Cr(Ⅵ)对细胞内抗氧化系统的影响以及产生自由基的能力。2.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱Cr(Ⅵ)处理后提取肝细胞线粒体用Clark氧电极通过记录氧耗(nmol/min/mg protein)来检测线粒体呼吸功能,指标包括三态呼吸、四态呼吸以及呼吸控制率等；用不同浓度的Cr(Ⅵ)(0、4、8、16、32μM)处理L-02肝细胞24h。提取线粒体用试剂盒检测线粒体呼吸链复合体I-V的活性；提取RNA并经逆转录成DNA后用real-timePCR法检测复合体I-VmRNA基因的表达；本研究同时用western blotting法检测了Cr(Ⅵ)对线粒体呼吸链复合体I-V蛋白表达水平的影响；同时检测了Cr(Ⅵ)对线粒体膜电位(△Ψm)、PTP孔开放度、膜通透性以及对肝细胞中LDH,ALT,AST活性的影响；高效液相色谱法检测Cr(Ⅵ)对肝细胞内腺苷酸含量(ATP、ADP、AMP)、ATP/ADP比值、以及能荷(EC)的影响。3.Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱在凋亡中的作用用PBS以及16、32μM Cr(Ⅵ)处理L-02肝细胞24h,经荧光探针CM-H2DCFDA孵育后在荧光显微镜下检测ROS的生成情况,同时用已被证实可诱导ROS生成增加MRCC I抑制剂ROT用做阳性对照；用不同MRCC的底物作用于肝细胞线粒体后测定Cr(Ⅵ)还原速率检测Cr(Ⅵ)在线粒体中的还原位点；本研究推断ROS在Cr(Ⅵ)诱导的L-02肝细胞毒性中发挥了重要的作用,故用抗氧化剂NAC抑制ROS来证实；检测NAC对不同浓度Cr(Ⅵ)暴露后的肝细胞ATP含量的影响；检测Cr(Ⅵ)暴露后对p53mRNA以及蛋白表达水平的影响以及NAC的作用；检测NAC预处理对不同浓度的Cr(Ⅵ)处理后热休克蛋白表达的影响；流式细胞仪检测肝细胞细胞周期的分布情况；为阐明Cr(Ⅵ)诱导的L-02肝细胞细胞周期分布变化的原因,本研究用荧光定量PCR法以及western blotting法检测了Cr(Ⅵ)作用后细胞S期检查点蛋白(Tof1、Mrc1)以及S期相关基因(CDK2,Cyclin E)的表达水平,同时也检测了G2/M期检查点蛋白(BubR1、Mad2)以及相关基因(Cyclin B、CDC25)表达水平的影响；未验证Cr(Ⅵ)诱导的细胞周期阻滞是否与p53相关,本研究选用特异性的p53抑制剂PFT-a来阻断p53的作用；检测PFT-a对不同浓度Cr(Ⅵ)处理组L-02肝细胞中p53、Mrc1、BubR1以及细胞周期分布的影响；除p53外,本研究也检测了Cr(Ⅵ)对NF-κB、PI3K/AKT通路的影响以及ROS在其中的作用。4.Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱在早衰中的作用用PBS或10nM的Cr(Ⅵ)处理L-02肝细胞,每周2次,每次24h,持续4周；SA-B-Gal染色检测早衰的发生；流式细胞仪细胞周期分布的分析；检测Cr(Ⅵ)对早衰L-02肝细胞中衰老、坏死、凋亡以及增殖细胞比例的影响,从而鉴别早衰与凋亡；用氧化敏感型荧光探针CM-H2DCFDA在荧光显微镜下检测ROS的生成情况；由于线粒体呼吸链复合体的抑制通常引发线粒体超氧化物的产生,本研究用线粒体超氧化物探针MitoSOX Red特异性标记超氧化物的产生情况；检测Cr(Ⅵ)诱导的早衰L-02肝细胞中线粒体呼吸链复合体(MRCC) Ⅰ-Ⅴ活性；检测有或无NAC预处理作用时Cr(Ⅵ)对肝细胞中p53mRNA表达水平的影响；Cr(Ⅵ)诱导的早衰L-02肝细胞中p53磷酸化蛋白的检测；有或无NAC预处理作用时Cr(Ⅵ)对肝细胞中衰老通路(p53-p21WAF1/CIP1、Rb-p16INK4a)蛋白水平以及对肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平的影响；为证实是否ROS诱导细胞发生早衰的功能完全依赖于p53的功能,本研究用脂质体转染在肝细胞中敲除p53,用无靶基因作用的Scramble(Scr)做为对照；用PBS或10nM的Cr(Ⅵ)处理L-02-Scr以及L-02-p53shRNA,每周2次,每次24h,持续4周；检测p53敲除对Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞早衰发生以及检测衰老细胞百分比的影响；检测p53敲除对Cr(Ⅵ)暴露后肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平的影响。研究结果1.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的抑制存在明显的剂量-效应依存关系,为保证细胞存活率在一个比较适宜的范围(>70%)以及考虑到统计学分析的需要,本研究各个指标检测选用Cr(Ⅵ)的处理浓度为4、8、16、32μM。Cr(Ⅵ)处理后的肝细胞呈现凋亡细胞特征性的梯状DNA条带。TUNEL实验证实Cr(Ⅵ)处理后损伤的DNA片段增加,即Cr(Ⅵ)可以诱导L-02肝细胞发生凋亡,且凋亡的细胞数目随着Cr(Ⅵ)染毒浓度的增加而增加。Cr(Ⅵ)处理后无论是凋亡细胞或是晚期凋亡坏死细胞都随Cr(Ⅵ)染毒浓度的增加而增加,呈现明显剂量-效应关系。Caspase-8参与的死亡受体依赖性凋亡通路以及Caspase-9参与的非死亡受体依赖性凋亡通路均参与到了Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞凋亡之中。Cr(Ⅵ)通过抑制HSP70与HSP90的表达水平而影响caspase-3的活性。对GSH、MDA以及SOD的检测结果说明Cr(Ⅵ)明显影响细胞内抗氧化系统以及自由基产生能力。2.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱Cr(Ⅵ)抑制线粒体三态呼吸而并未对四态呼吸产生影响,呼吸控制率RCR明显降低。不同浓度的Cr(Ⅵ)处理显著抑制了MRCCⅠ和Ⅱ的活性、mRNA以及蛋白表达水平,尤其是MRCCⅠ。Cr(Ⅵ)处理后,线粒体的膜电位降低、PTP开放度增大、膜的通透性升高,酶类外溢。Cr(Ⅵ)降低肝细胞内腺苷酸含量、ATP/ADP比值以及EC。3.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱在凋亡中的作用Cr(Ⅵ)处理组肝细胞ROS生成量随着染毒浓度的增加而增加。用MRCCⅠ的底物谷氨酸以及苹果酸(Glu+Mal)处理肝细胞线粒体时Cr(Ⅵ)的还原速率均明显增大,说明Cr(Ⅵ)在MRCCⅠ处被还原。NAC阻断了各个Cr(Ⅵ)处理组中ROS的堆积,肝细胞中ATP降低趋势有明显地缓解,抑制细胞凋亡通路的激活从而抑制了肝细胞凋亡的发生。Cr(Ⅵ)处理组细胞p53蛋白表达水平明显增加,且呈现明显的剂量-效应关系,而NAC明显抑制了p53mRNA水平的表达。Cr(Ⅵ)是通过调节ROS进而调节热休克蛋白的表达而激活caspase-3。低浓度Cr(Ⅵ)(4μM)处理组细胞发生明显的S期细胞周期阻滞,而高浓度Cr(Ⅵ)(16、32gM)处理组细胞发生明显的G2/M期细胞周期阻滞。进一步研究发现低浓度Cr(Ⅵ)导致L-02肝细胞发生S期细胞阻滞的原因可能为诱导S期检查点蛋白基因(Tof1、Mrc1)以及S期相关基因(CDK2、Cyclin E)表达水平下降有关；而高浓度Cr(Ⅵ)导致L-02肝细胞发生G2/M期细胞阻滞的原因可能为诱导G2/M期检查点蛋白基因(BubR1、Mad2)以及S期相关基因(Cyclin B、CDC25)表达水平下降有关。NAC以及PFT-a预处理明显缓解了细胞的S期或G2/M期阻滞,说明Cr(Ⅵ)通过调控ROS水平进而调控p53而诱导L-02肝细胞细胞周期阻滞。Cr(Ⅵ)诱导的ROS堆积除作用于p53外也作用于NF-kB与PI3K/AKT通路,参与细胞毒作用。4.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱在早衰中的作用低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰。早衰细胞出现明显的S期细胞周期阻滞,SA-β-Gal活性明显增高。与Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡中ROS的生成机制类似,早衰细胞中Cr(Ⅵ)可以选择性作用于线粒体呼吸链的易感位点MRCCⅠ和MRCC Ⅱ而诱导ROS的大量堆积。衰老细胞中磷酸化p53(ser15)明显升高,p53被明显激活, NAC预处理明显降低了对照组和早衰细胞中p53水平,提示ROS可以对p53进行转录调控。对Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中衰老通路的分析发现p53-p21WAF1/CIP1通路,而不是Rb-p16INK4a通路参与了肝细胞早衰的过程。早衰细胞中ROS调节p53后进而调节促存活基因Bcl-2、Mcl-1的表达而抑制肝细胞的增殖能力,通过调节S期相关蛋白CDK2、Cyclin E进而诱导S期细胞周期阻滞。NAC预处理明显抑制了细胞早衰的发生。肝细胞中敲除p53后发现p53的缺失抑制了细胞早衰的发生。虽然Cr(Ⅵ)处理后的L-02-p53shRNA细胞未发生早衰,但其ROS生成量仍明显增高,证实Cr(Ⅵ)诱导的L-02细胞发生早衰依赖于ROS,而ROS功能的发挥完全依赖于p53。研究结论1.Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞发生凋亡,且Caspase-8介导的死亡受体依赖性凋亡通路以及Caspase-9介导的非死亡受体依赖性凋亡通路均参与其中。Caspase-3的活化与热休克蛋白(HSP70,HSP90)的抑制有关。2.Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链的抑制以及能量代谢障碍,表现为三态呼吸的抑制、呼吸控制率的降低和ATP的耗竭等。3.线粒体呼吸链功能紊乱的直接结果是ROS的大量堆积。Cr(Ⅵ)通过抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ的活性而诱导ROS水平剧增,且Cr(Ⅵ)在MRCC Ⅰ处被还原。低浓度或高浓度Cr(Ⅵ)处理分别发生S期或G2/M期细胞周期阻滞,其机制与Cr(Ⅵ)作用后ROS调控p53,后者进一步调控细胞周期检查点蛋白以及细胞周期相关蛋白有关。Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡依赖于ROS-p53、NF-κB以及PI3K/AKT通路。4.低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰,以不可逆性的S期细胞周期阻滞以及SA-β-Gal活性的明显增高为特征。p53-p21WAF1/CIP1通路参与早衰过程。ROS通过调节促存活基因以及S期相关蛋白而诱导S期周期阻滞。敲除p53的肝细胞经Cr(Ⅵ)诱导后不发生早衰,提示早衰的发生完全依赖于ROS-p53功能。