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近年来，中国已成为以水产养殖业为主的渔业大国。然而高密度、集约化的养殖方式使得各种细菌性和病毒性疾病频发。为了防治这些疾病而增加抗生素的使用量，导致了大量耐药病原菌的产生，由于药物残留引发的如多宝鱼硝基呋喃类残留等水产食品安全事件，不仅对人民的身体健康造成了威胁，更严重影响了我国的水产品在国际上的竞争力，制约了我国水产品出口业的发展。
抗菌肽作为一种替代传统抗生素的绿色饲料添加剂，不仅有强抗菌作用，且动物采食后在体内一般无残留；长期添加，细菌也不易获得耐药性，使用效果稳定。它是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽，广泛存在于各种生物体内，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。本研究所涉及到的肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)最初从人的血液超滤产物中分离得到，含有2对二硫键。最近从斑点叉尾鮰的肝脏中也克隆到了LEAP-2基因，但未对LEAP-2基因做进一步的重组DNA表达。基于化学合成的人的LEAP-2对革兰氏阴性、阳性菌均表现出抗菌活性，因而可以推测LEAP-2作为一种替代抗生素的绿色饲料添加剂在水产养殖安全中的作用。由于天然抗菌肽在机体内的含量甚微、提取纯化困难，而化学合成成本又高，因此，本研究采用重组DNA技术来制备抗菌肽。
本研究内容分三部分，第一部分主要内容为斑点叉尾鲴LEAP-2基因的cDNA克隆。从斑点叉尾鲴的肝脏中提取总RNA，根据已知的斑点叉尾鲴LEAP-2基因序列设计引物，以第一股cDNA为模板，用RT-PCR法扩增得到长度为375bp的LEAP-2基因，并进行了序列测定。分子生物学软件BioEdit的分析表明，该基因编码94个氨基酸残基组成的多肽；信号肽预测分析表明：该肽的氨基端的信号肽由28个残基组成，成熟肽含有41个残基。斑点叉尾鲴与其他生物之间LEAP-2的氨基酸序列的比对结果表明：斑点叉尾鲴与鱼类之间LEAP-2的氨基酸序列有较高同源性，与哺乳动物之间显示了低的LEAP-2氨基酸序列同源性，但是无论对于鱼类还是哺乳动物都显示出高度保守的位于多肽的羧基端区域的4个半胱氨酸残基，相邻的两个半胱氨酸残基间形成二硫键，它们与LEAP-2的抗菌活性关系密切。
第二部分主要内容为LEAP-2基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达。以纯化的LEAP-2基因为模板，设计带有EcoR I和HindⅢ酶切位点的引物，扩增得到长度为327bp的片段，命名为Ip-2，将该片段与表达质粒pET30a、pET32a分别做双酶切，利用DNA重组技术，在T4 DNA连接酶的作用下，将Ip-2片段与表达质粒pET30a、pET32a连接起来。经过PCR检验、双酶切鉴定以及序列测定，结果证实：成功构建了pET30a-IpL-2、pET32a-IpL-2两个重组表达质粒。
将重组表达质粒pET32a-IpL-2转化宿主工程菌E.coli BL21(DE3)，采用25℃，终浓度为0.7mmol/L的IPTG诱导融合蛋白表达。Tricine-SDS-PAGE电泳分析的结果表明：融合蛋白得到了高程度的表达，所得的融合蛋白TrxA-IpL-2分子量为30kD，与预计分子量相符。重组质粒pET32a-IpL-2表达的融合蛋白以包含体为主，但已经产生了一定比例的可溶性蛋白。
第三部分主要内容为所表达的融合蛋白的纯化及鉴定。融合蛋白TrxA-IpL-2带有6×His标签，因此可利用Ni-IDA琼脂糖凝胶柱的亲和作用对其进行纯化。对表达融合蛋白的宿主菌BL21(DE3)进行超声破碎后，离心分离出包含体形式的融合蛋白溶液，转移至Ni-IDA琼脂糖凝胶柱上，用漂洗缓冲液A洗去非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液B洗脱得到纯的TrxA-IpL-2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE电泳的分析表明，得到了高纯度的TrxA-IpL-2融合蛋白。
最后采用半干转印法对表达的融合蛋白做Western blot分析，选用的一抗为抗His标签鼠单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)；洗去二抗后，用DAB染色进行观察，NC膜上呈现出单一条带，进一步证明了融合蛋白在宿主菌中得到了表达，为进一步进行功能性研究提供了保证。