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目的:流式细胞仪结合荧光标记抗体对细胞表面低丰度蛋白的检测不如人意。微流控芯片液滴与细胞尺寸相近,特别适合单细胞检测分析。本工作以微流控芯片液滴为技术平台,应用酶联放大原理,在单细胞水平上检测细胞表面蛋白的表达。方法:本实验属于方法学研究,将本文建立方法与已有方法进行分析比较,确定方法的可靠性。1、选择合适的标记酶与荧光底物,本实验选用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP),荧光底物为荧光素二磷酸酯四铵盐(Fluorescein diphosphate,tetraammonium salt,FDP)。2、选择表达上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)的A549细胞,用Anti-Ep CAM抗体(Biotin标记)标记,再用标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素(Alkaline phosphatase-Streptavidin,ALP-SA)标记,将所得细胞悬液与荧光底物FDP溶液同时包入液滴,在荧光显微镜观察统计包含细胞且有荧光信号的液滴数与包裹细胞的液滴总数,计算表达Ep CAM的细胞比例。3、将A549细胞与Anti-Ep CAM抗体(Biotin标记)标记,再与FITC标记的链霉亲和素(FITC-SA)标记,所得细胞悬液一部分生成液滴,荧光显微镜观察计数,另一部分采用流式细胞仪检测表达Ep CAM的细胞比例。4、将ALP或FITC标记的A549细胞悬液与未进行任何标记处理的A549细胞悬液按照细胞数量比1:1、1:3、1:10进行混合,分别采用微流控芯片液滴技术和流式细胞术检测表达Ep CAM的细胞比例。5、对两种方法的细胞检测阳性率进行比较。结果:1、微流控液滴技术检测未标记处理的A549细胞悬液,Ep CAM呈阳性的细胞比例为1.05%;同样方法检测ALP标记的A549细胞,所得阳性比例为81.32%;同样方法检测FITC标记的A549细胞,荧光显微镜下无法观察到荧光信号。2、微流控液滴技术检测ALP标记与未标记细胞数量比1:1、1:3、1:10的混合悬液,阳性率分别为42.78%、26.44%、8.29%。3、流式细胞仪检测未标记处理的A549细胞悬液(即根据阴性对照设门),阳性率为0.73%;同样方法检测FITC标记的A549细胞,阳性率为50.82%。4、流式细胞仪计数检测FITC标记与未标记细胞数量比1:1、1:3、1:10的混合悬液,阳性率分别为25.50%、15.08%、5.58%。结论:相对于流式细胞术,微流控液滴技术结合酶联放大反应,可更灵敏地检出细胞表面表达的蛋白Ep CAM。该方法适合细胞表面低丰度蛋白的检测。