一条新的转移相关基因mag-1的研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 3次 | 上传用户:zou123456ting
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我室张金强博士利用抑制消减杂交结合基因芯片技术,从一对具有不同转移能力的模型细胞株(人肺巨细胞癌高低转移细胞株PLA801 D、C)中筛选获得79条与转移表型正相关EST片段。其中3号片段经电子延伸获得“全长”序列,命名为mag-1。通过对mag-1的系列研究,发现mag-1基因可能通过某些环节或机制影响肺癌细胞某些转移相关的生物学特性,是潜在的肿瘤转移相关基因。 为了深入研究其性质、结构、定位、分布及生理功能,将其重组到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后,转化BL21表达菌。对以包涵体形式表达的重组蛋白进行鉴定后,大量制备重组蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳白兔,经过多次免疫后获得了高效价的MAG-1多克隆抗体。 但在应用MAG-1多克隆抗体,通过免疫印迹方法对模型细胞内MAG-1蛋白质的内源性表达情况进行分析时,在分子量约45KD区域有明显的阳性条带存在,并且在PLA801 D中的表达量明显高于PLA801 C中的表达量,而在预期分子量区域——14KD则未能检测到相应的条带。于是将MAG-1氨基酸序列进行同源性检索,结果发现该序列与新近登录的MGC11324蛋白(GenBank登录号为NM032717)的3’端具有100%的同源性。MGC11324蛋白是2004年8月一个日本研究小组在分析人肝母细胞瘤的基因表达谱和筛选与正常肝细胞的差异基因中发现的。但他们对于MGC11324蛋白并未进行深入研究,亦没有通过实验验证该蛋白质产物的真实存在。在此基础上,我们利用RT-PCR及测序技术确认NM032717基因也存在于PLA801 D、C中,最后利用mag-1基因特异的探针对包含8种人类肿瘤组织RNA样品的尼龙膜进行Northern杂交,结果表明该基因在所有的肿瘤组织中都有一个约为2.2kb转录本,卵巢肿瘤组织中还有一个约3.5kb的转录本,这可能是一个组织特异性剪接变异体。mag-1在8种肿瘤组织中均有表达,表达量从高到低的顺序为:子宫肿瘤>肾肿瘤>乳腺肿瘤>卵巢肿瘤>胃肿瘤>肺肿瘤>直肠肿瘤>结肠肿瘤。从而弄清楚我们原来的mag-1基因(与GenBank登录号为BC006236序列高度同源,但没有移码突变)不是一个全长的基因,而是NM032717基因的一部分,这两个基因是一个基因。 在获得了mag-1基因的全长序列后,我们对其进行了详细的生物信息学分析,结果如下:mag-1定位于人染色体的4q21.23,由12个外显子组成,基因长约为69kb,mag-1的理论蛋白产物由434个氨基酸残基组成,分子量为48.7KD,等电点为9.05,半衰期为30小时,是比较稳定的蛋白质。在224-333氨基酸区域含有磷酸酰基转移酶结构域,该基因可能参与代谢。经预测,mag-1理论蛋白产物的二级结构以α螺旋为主,含有较多的无规卷曲和少量的片层结构。并且具有8个蛋白激酶C磷酸化
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