论文部分内容阅读
近年来免疫检查点抑制剂程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）和其配体（PD-L1）的抗体在肺癌治疗中发挥了十分重要的作用,可有效抑制肿瘤的增长,延长了患者的生存期。但是在临床使用过程中,单纯应用PD-1抗体或者PD-L1抗体,未获得满意的临床疗效。原因之一为肺癌细胞表面表达PD-L1,其与机体内PD-1结合导致肿瘤免疫逃逸。半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）是一种半乳糖苷结合糖蛋白,在细胞内外都存在广泛的表达。研究发现Gal-3能调节免疫细胞的功能,参与细胞和体液免疫过程,而且在肺癌细胞中高表达,与肺癌的发生发展密切相关。JAK-STAT分子信号通路是肿瘤细胞内最为重要的分子信号通路之一,参与癌细胞的生长和迁移,STAT3是JAK-STAT信号通路中的关键成员,异常激活STAT3能够诱导肿瘤细胞PD-L1表达水平的升高,从而诱导免疫抑制。既往研究发现肿瘤微环境普遍存在乏氧现象,乏氧是诱导肿瘤细胞增殖或者侵袭力增强的一个原因。因此本研究探讨了缺氧环境下是否诱导肺癌细胞表达分泌Gal-3,Gal-3能否通过调节肿瘤细胞内的JAK-STAT分子通路而影响其PD-L1的表达,进而参与免疫抑制过程。继而我们研究了抑制Gal-3能否降低肺癌细胞表面PD-L1的表达,从而解除免疫抑制。此外我们也探讨了Gal-3抑制剂是否能够直接作用T细胞的激活过程、改善T细胞功能。最后我们分析了Gal-3抑制剂能否在体内抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,是否能够增强PD-L1抗体对小鼠肺癌移植瘤的作用。本研究的主要内容分为以下三个部分:第一部分半乳糖凝集素-3在非小细胞肺癌中的表达及其通过STAT3途径对PD-L1调控作用研究目的:测定非小细胞肺癌细胞中Gal-3的表达水平,探讨在非小细胞肺癌中Gal-3及Gal-3抑制剂对JAK-STAT3分子信号通路的影响,以及对PD-L1表达水平的影响。方法:体外培养人源肺腺癌A549细胞系,将其置于缺氧环境,采用实时定量PCR检测细胞内Gal-3 m RNA水平,用酶联免疫吸附实验检测人源肺腺癌A549细胞Gal-3分泌量。采用不同浓度的Gal-3抑制剂处理体外培养的人源肺腺癌A549细胞72小时,进行MTT染色、酶标仪检测OD值法测定细胞活力,计算确定Gal-3抑制剂的IC50值,用于后续试验。采用Gal-3或者Gal-3抑制剂和人源肺腺癌A549细胞共培养,采用免疫蛋白印迹方法检测细胞内STAT3分子信号通路的活性,以及PD-L1表达情况。此外采用STAT3的沉默RNA（Si RNA）转染进入人源肺腺癌A549细胞内,抑制STAT3表达,采用免疫蛋白印迹验证抑制效果。并检测阻断STAT3通路活性后,Gal-3是否通过STAT3信号途径调节PD-L1表达。结果:1.缺氧诱导人肺腺癌A549细胞Gal-3的表达和分泌。缺氧组人肺腺癌A549细胞内Gal-3的m RNA水平明显高于空白对照组,缺氧组细胞内Gal-3的m RNA水平是空白对照组的3.3倍左右（P<0.05）。此外,采用免疫酶联吸附实验方法检测细胞培养基中Gal-3水平,对照组肿瘤细胞培养基中Gal-3水平为（320.67±12.34）pg/ml,而缺氧组细胞培养基中Gal-3水平为（1866.67±32.25）pg/ml,缺氧组肿瘤细胞培养基中Gal-3水平明显升高（P<0.05）。2.检测Gal-3抑制剂对人源肺腺癌A549细胞的IC50。结果显示Gal-3抑制剂对人源肺腺癌A549细胞IC50是1.04μM。3.Gal-3通过STAT3通路调控PD-L1表达。首先根据之前其他的研究结果,确定体外Gal-3处理人源肺腺癌A549细胞的浓度为0.5μg/ml。然后肺癌细胞接受安慰剂、Gal-3、Gal-3抑制剂、STAT3的si RNA处理后,分析细胞STAT3表达及活性和PD-L1表达水平。免疫蛋白印记结果显示;Gal-3组肿瘤细胞STAT3表达水平较对照组虽然没有区别,但Gal-3组人源肺腺癌A549细胞的STAT3磷酸化水平为对照组的189.33%（P<0.01）,PD-L1表达水平为对照组的188.36%（P<0.01）。同样,Gal-3抑制剂组肿瘤细胞STAT3表达水平较对照组虽然没有区别,但Gal-3抑制剂组肿瘤细胞STAT3磷酸化水平为对照组的48.72%（P<0.05）,PD-L1表达水平为对照组的56.37%（P<0.01）。转染si RNA的人源肺腺癌A549细胞内的STAT3表达,仅为对照组的23%抑制剂处理后与si RNA组的PD-L1表达水平没有明显差别（P>0.05）,但均明显低于对照组（P>0.05）。小结:缺氧环境下人源肺腺癌A549细胞Gal-3的表达和分泌水平明显升高。Gal-3能够激活肺癌细胞的STAT3信号途径,从而促进肺癌细胞表达PD-L1。抑制Gal-3表达后肺癌细胞内STAT3活性降低,其表面PD-L1的表达也降低。通过转染si RNA抑制肺癌细胞STAT3基因后,Gal-3失去调节肺癌细胞PD-L1表达的能力。第二部分半乳糖凝集素-3抑制剂对免疫细胞的激活和功能调控研究目的:Gal-3抑制剂对人外周血单核细胞功能的调节及机制。方法:首先采集正常人外周血标本,提取外周血中单核细胞。体外培养人源肺腺癌A549细胞,通过冻融法制作肿瘤细胞抗原。用肿瘤细胞抗原、脂多糖、细胞因子（重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人白细胞介素2）刺激人外周血单核细胞,然后采用流式细胞学检测CD8阳性T细胞增殖能力,酶联免疫吸附实验检测细胞炎症因子的分泌（肿瘤坏死因子α,干扰素γ）。此外用肿瘤抗原、Gal-3抑制剂、细胞因子和PD-L1抗体刺激人外周血单核细胞,再将其与人源肺腺癌A549细胞以一定比例共同培养,采用4小时51Cr释放法方法观察人外周血单核细胞的细胞毒性变化,以评估人外周血单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效果。结果:1.Gal-3抑制剂能够提高外周血单核细胞中的T细胞增殖。流式细胞法检测结果显示,Gal-3抑制剂组的CD8+细胞毒性T细胞数量明显高于对照组（77.09%VS 10.51%,P<0.05）。2.Gal-3抑制剂能够提高人外周单核细胞分泌炎症因子Gal-3抑制剂组的IFN-γ和TNF-α的水平分别为（1233.00±23.20）pg/ml和（1679.84±40.20）pg/ml,而对照组IFN-γ和TNF-α的水平分别为（782.33±21.20）pg/ml和（1257.47±42.23）pg/ml,Gal-3抑制剂组的IFN-γ和TNF-α的水平均明显高于对照组（IFN-γ两组比较P<0.01,TNF-α两组比较P<0.01）。3.Gal-3抑制剂能够提高人外周单核细胞及PD-L1对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能。结果显示Gal-3抑制剂组人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能明显高于安慰剂对照组（P<0.05）。同样我们的研究结果也证实,PD-L1抗体组较安慰剂组也能明显提高人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能（P<0.01）。Gal-3抑制剂和PD-L1抗体联合组人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能明显高于Gal-1抑制剂组和PD-L1组（P<0.01）。小结:Gal-3抑制剂能够提高人外周血单核细胞细胞的活性和功能,以及对肺癌细胞的杀伤能力。而且Gal-3抑制剂能够提高PD-L1抗体介导的人外周血单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的体外杀伤能力。第三部分半乳糖凝集素-3抑制剂联合PD-L1抗体体内抗肿瘤作用的研究目的:检测Gal-3抑制剂对裸鼠人源肺腺癌5549移植瘤的抑制作用,以及Gal-3抑制剂与PD-L1抗体联合应用对裸鼠人源肺腺癌A549移植瘤的抑制效果。方法:采用BALB/C小鼠,用皮下注射方式将人源肺腺癌A549细胞种植于小鼠皮下,待瘤体形成后,经尾静脉向小鼠体内注射人外周血单核细胞,再随机分组,包括:Gal-3抑制剂组、PD-L1抗体组、Gal-3抑制剂联合PD-L1抗体、安慰剂组。然后监测小鼠肿瘤生长速度。以安慰剂治疗组为对照,计算各个治疗组中,Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体单独治疗对肿瘤生长的抑制率,以及Gal-3抑制剂与PD-L1抗体联合治疗对小鼠皮下移植瘤的抑制率,然后通过公式计算联合治疗指数,分析联合治疗产生的效应。此外收集小鼠肿瘤组织,称量肿瘤重量。最后采用免疫组织化学染色方法,检测小鼠肿瘤组织中CD3和颗粒酶B表达阳性情况,以评估T淋巴细胞的浸润和功能情况。并用ELISA法分析肿瘤组织的IFN-γ及IL-2的表达水平。结果:与安慰剂相比,Gal-3抑制剂和PD-L1抗体在单独应用时,均能抑制肿瘤的增殖,Gal-3对肿瘤生长的抑制率为23.94%;PD-L1抗体对肿瘤生长的抑制率为62.02%。而且当Gal-3抑制剂和PD-L1抗体联合应用时,对肿瘤生长的抑制率达到78.17%,能够产生协同效应,其联合治疗的效应指数为0.21,抑制肿瘤的能力明显优于上述两种药物单独应用。免疫组织化学染色也发现,联合治疗组小鼠的肿瘤组织内CD3阳性的T淋巴细胞数量明显高于Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体单独治疗组。而且联合治疗组肿瘤颗粒酶B阳性的淋巴细胞内的表达也明显高于Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体的单独治疗组。ELISA检测发现肿瘤组织中检测Gal-3抑制剂联合PD-L1抗体治疗组肿瘤组织中IFN-γ和IL-2的分泌量明显高于单独应用Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体组（P<0.05）。小结:Gal-3抑制剂能够抑制人源肺腺癌A549肿瘤的生长,而且Gal-3抑制剂能够提高肿瘤细胞内T淋巴细胞数量及功能,在与PD-L1抗体联合应用后,能够明显提高肿瘤浸润的淋巴细胞的功能,产生抑制肿瘤的协同效应。结论:肺癌细胞能够表达和分泌Gal-3,缺氧环境可促进Gal-3的表达和分泌;Gal-3可通过STAT3信号通路调控肺癌细胞PD-L1的表达,但尚不能完全抑制PD-L1的表达,表明Gal-3可能其它信号通路调节PD-L1的表达;Gal-3能够调节免疫细胞的数量和功能,并可增加肿瘤组织中T细胞浸润数量;Gal-3抑制剂和PD-L1抗体有协同抗肿瘤作用;Gal-3抑制剂可以抑制肿瘤的生长,其可能成为新的治疗靶点。