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目的:通过构建食管癌细胞株TE-13和ECA109中的人基因STAT1和H2AX低表达的人食管癌细胞株,观察人食管癌细胞TE-13、ECA109中STAT1和H2AX在mRNA水平、射线作用前后蛋白质水平和细胞核内斑点表达的变化,为进一步探讨抑制STAT1和H2AX基因蛋白表达对食管癌TE-13、ECA109细胞放射敏感性的影响提供理论基础。方法:根据STAT1和H2AX的mRNA序列,STAT1选择了4个19nts的靶序列,H2AX分别选择了2个19nts和2个21nts的靶序列设计并合成包含正、反义序列的互补单链DNA,同时设计一个无义对照序列。退火后插入pGCSIL载体的H1RNA启动子后产生pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL-STAT1-shRNA3、pGCSIL-STAT1-sh- RNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA2、pGCSIL- H2AX-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4和pGCSIL-negative;以上质粒均需要经过PCR和测序鉴定。鉴定正确后,转染TE13和ECA109细胞,采用western blotting的方法检测STAT1和H2AX的蛋白表达,比较四种质粒RNA的干扰效果,筛选出RNA干扰效果最佳的质粒,将干扰效果最佳的质粒与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞48h后,收集上清并过滤即为病毒液,该病毒液转染TE13和ECA109细胞72h后,采用Real-Time PCR和western blotting方法检测转染食管癌细胞中基因STAT1和H2AXmRNA水平及蛋白质水平的变化,并采用激光共聚焦显微镜检测细胞核内STAT1和H2AX斑点形成的变化。结果:①成功地将STAT1和H2AX shRNA与pGCSIL-GFP质粒连接并经细菌转化扩增后,再提取质粒DNA;②STAT1和H2AX shRNA转染人食管癌细胞珠TE13和ECA109后,其目的蛋白表达水平均下降明显,pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL- STAT1-sh- RNA3、pGCSIL-STAT1-shRNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL- H2AX-shRNA2、pGCSIL-H2AX-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4在TE13细胞系较空白对照组分别下降了75%、60%、26%、22%和81%、56%、21%、33%;在ECA109细胞系较空白对照组分别下降了34%、22%、72%、61%和29%、34%、74%、62%;③pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA3和慢病毒包装质粒混合物共转染工具细胞293T细胞,转染后8h更换为完全培养基,培养48h后,再收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到的高滴度慢病毒浓缩液收集上清并过滤为病毒液,该病毒液感染TE13和ECA109细胞72h后,在荧光显微镜下出现绿色荧光,荧光率达80%以上,即为人基因STAT1和H2AX蛋白低表达的食管癌细胞株;④对转染细胞株采用Real-Time PCR和western blotting方法进行鉴定,结果发现基因STAT1蛋白低表达的食管癌TE13转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了73%和69%,基因STAT1蛋白低表达的食管癌ECA109转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了66%和65%;基因H2AX蛋白低表达的食管癌TE13转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了66%和83%,基因H2AX蛋白低表达的食管癌ECA109转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了68%和63%;⑤用转染的食管癌细胞株应用激光共聚焦显微镜检测细胞核内斑点情况,结果发现4Gy放射线照射和顺铂处理后细胞核内STAT1和H2AX斑点的形成明显减少。结论:采用质粒连接的STAT1和H2AX shRNA转染TE13和ECA109细胞后,其目的蛋白的表达均被明显抑制,成功构建了STAT1和H2AX shRNA表达载体pGCSIL-STAT1、pGCSIL-H2AX;转染的食管癌细胞后STAT1和H2AX蛋白表达明显降低,而且细胞核内STAT1和H2AX斑点的形成明显减少。