目的肺癌是常见的恶性肿瘤之一,在我国大中城市发病率和死亡率很高,在发达国家16种常见肿瘤中,发病率和死亡率居首位。近年来对肺癌的研究基本上分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌两种类型,小细胞肺癌是肺癌中分化最低,性质最恶的一型。尽管以手术为主的多学科治疗取得很大发展,肺癌的5年生存率仍徘徊于20%左右。只有不断完善肺癌发病机制的研究并由此开展新的治疗方法,才能有效提高肺癌疗效和预后。肺癌的发生和发展与肿瘤细胞免疫逃逸有关。机体发生肿瘤时,肿瘤细胞可以凭借多种方式逃避机体免疫系统的监控、攻击而继续增殖生长,即肿瘤的免疫逃逸。近年许多研究已经证实肿瘤细胞膜有Fas和（或）FasL表达,其FasL能与浸润肿瘤的T淋巴细胞的Fas结合,启动T细胞内凋亡信号,通过凋亡从而清除T细胞;而肿瘤细胞膜的Fas却对T淋巴细胞的FasL结合后的敏感性降低,此外,肿瘤细胞还可以主动减少Fas受体的表达或通过Fas突变,避免T细胞FasL的攻击作用,从而使癌细胞逃避机体免疫机制,促进肿瘤的生长和转移。目前研究表明,肺癌细胞中存在Fas/FasL系统的表达异常。有研究发现,与癌旁组织比较,在肺癌组织中Fas表达减少,FasL表达增加。认为肺癌细胞由于Fas表达水平低下,逃避了T细胞的杀伤,造成Fas,FasL启动的癌细胞凋亡作用减弱,而癌细胞膜表达增加的FasL反能结合于激活T细胞的Fas受体,使T细胞凋亡,因而,肺癌细胞可利用低表达Fas或高表达FasL,逃避或反击T淋巴细胞的攻击,通过不同凋亡途径使癌细胞逃避机体免疫杀伤而达到肿瘤细胞的恶性增殖。国内谢聪颖实验研究报道中检测了非小细胞肺癌Fas蛋白表达,其中鳞癌阳性表达率为58.3%,腺癌为44.4%,与Nambu等报道的肺癌Fas表达阳性率47.6%相近,低于正常肺的表达,且同样主要位于细胞质内,而较少有细胞膜表达;肺癌细胞FasL阳性表达率57.1%,明显高于正常肺的表达,FasL表达阳性肺癌的转移淋巴结其FasL表达结果全部阳性,FasL表达阳性率与TNM分期密切相关。推测FasL表达具有恶性较高的生物学行为,促使肿瘤逃避机体免疫监视。综上所述,Fas/FasL的异常表达或功能紊乱在肺癌细胞的凋亡、生长、转移和逃避免疫监视等方面发挥着重要作用。目前国内较少有关于小细胞肺癌Fas/FasL基因表达情况及其与凋亡关系的研究报道,国外也多限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌细胞系的研究。所以进一步深入研究Fas/FasL表达的调控机制及其介导的凋亡信号的传导,将有助于明确Fas/FasL系统介导的细胞凋亡在小细胞肺癌发生、发展中的意义。为肺癌的基因治疗和免疫治疗提供新的方法和思路。方法1、实验材料选取中国医科大学附属第一医院胸外科1998年1月——2002年12月收治,术前未经放疗、化疗,临床随访资料完整,术后病理证实为小细胞肺癌共46例（为石蜡包埋组织标本）,其中男26例,女20例,年龄26-72岁,平均54岁,按照1997年国际抗癌联盟TNM分期,Ⅰ期14例,Ⅱ期11例,Ⅲ期21例,癌旁5cm正常肺组织石蜡标本20例。另选取2004年1月—2006年6月手术的SCLC患者16例,其中男9例,女7例,年龄33-64岁,术前未经化疗或放疗,切取瘤组织于1小时内放入液氮速冻,-70℃冰箱保存。2、实验方法（1）PT-PCR方法检测Fas、FasLmRNA表达SCLC石蜡包埋标本修块,脱蜡后Trizol一步法提取总RNA,行逆转录及PCR反应。反应体系中加入2μl MgCl₂,10×RT Buffer 1μl,RNAse-free水3.75μl,dNTPMixture（各10mM）1μl,RNAse抑制剂0.25μl,AMV逆转录酶^*1 0.5μl,Random9 mers/Oligo dT-Adaptor Primer/特异性下游引物0.5μl,按以下条件进行反转录,42℃—30min、99℃—5min、5℃—5min。反应条件:94℃预变性2min;94℃40秒、57℃40秒、72℃1min一个循环,共计40个循环;72℃延伸10min。引物序列Fas上游引物:5‘CCAAATGCAGAAGATGATTGTGTG‘3下游引物:5’TGCCACTGTTTCAGGATTTAAGGTTG3’,FasL上游引物:5‘-CTGGGGATGTTTCAGCTCTTC-3’下游引物:5‘-CTTCACTCCAGAAAGCAGGAC-3’,β-actin上游引物:5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’,下游引物5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’。PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳在紫外线下成像。应用TaKaRa公司100bp梯度Makers为分子大小对照确定电泳条带。（2）SP免疫组织化学方法检测Fas、FasL、Bcl-2蛋白的表达石蜡切片常规脱蜡,脱水,组织抗原修复,3%过氧化氢灭活,PBS冲洗,滴加正常非免疫动物血清,生物素标记一抗4℃过夜,PBS冲洗,滴加生物素标记二抗,室温孵育,滴加链霉菌抗生物-过氧化物酶,PBS液冲洗,DAB显色,苏木素复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。结果判定:细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒,并根据肿瘤组织细胞的染色率和染色强度进行判断。参照Monica的半定量计数方法。统计分析:数据统计利用SPSS 13.0,Fisher精确检验进行统计。相关性分析采用Spearman相关性检验;Kaplan-Meier法估计生存差异,应用Log rank和Breslow检验。（3）流式细胞技术检测小细胞肺癌Fas、FasLmRNA表达与细胞凋亡水平之间的相关性。取新鲜肿瘤组织,制备单细胞悬液,经胰酶消化后,400目尼龙网过滤,离心,以PBS调整细胞数为1×10⁶/ml,进行Annexin V/PI双染色,将制备好的单细胞悬液中加入5μl FITC- Annexin V及5μl PI,室温下闭光静置,加入400μl1×Buffer后立即进行流式细胞仪分析,然后在Macintosh 9.5计算机机上用相关软件分析数据。测量前,以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CV值在3.0%以内。正常细胞FITC及PI均低染（FITC^- PI^-）,在流式细胞分析图上为R₁区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI低染（FITC⁺ PI^-）,图示为R₂区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染（FITC⁺ PI⁺）,图示为R₃区细胞簇（图3-2）。计算凋亡细胞所占的百分比。统计学处理所得数据,用SPSS13.0软件进行t检验。结果1、小细胞肺癌（SCLC）中Fas mRNA阳性表达率为47.8%,明显低于在正常肺组织中的表达率（80%）,差异有统计学意义;P＜0.05（X²=5.907;P=0.015）。2、SCLC中FasL mRNA阳性表达率为58.7%,明显高于在正常肺组织中的表达率（35%）,差异有统计学意义;P＜0.05（X²=4.591;P=0.032）。3、Fas mRNA在SCLC性别,年龄,病理分期,淋巴结转移因素的阳性表达率上差别无统计学意义。4、FasL mRNA在SCLC性别,年龄因素的阳性表达率上差别无统计学意义。但在转移淋巴结和TNM分期中的表达差异有统计学意义。5、Spearman相关分析显示FasmRNA与FasLmRNA在SCLC和正常肺组织中的表达成负相关,相关系数为r=-0.302,P=0.042。6、FasLmRNA表达阳性组与阴性组SCLC病人Kaplan-Meier生存曲线经log-rank和Breslow双重检验,有显著统计学意义（log-rank检验X²值=7.596,P=0.006;Breslow检验X²值=8.286,P=0.01）。7、Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达均定位于细胞膜,部分有细胞浆着色阳性产物呈弥漫性或散在分布粗细一致的黄色或棕黄色颗粒。8.SCLC中Fas蛋白阳性表达率为39.1%,明显低于在正常肺组织中的表达率（70%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;FasL蛋白阳性表达率为54.3%,明显高于在正常肺组织中的表达率（25%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;Bcl-2蛋白阳性表达率为34.8%,高于在正常肺组织中的表达率（10%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。9、Fas、FasL、Bcl-2蛋白阳性表达率在病人的性别,年龄,PTNM分期,淋巴结转移因素差异上无统计学意义。10、经Spearman相关分析显示Fas、FasL、Bcl-2蛋白在SCLC中的表达无明显相关性。11、FasL蛋白表达阳性组与阴性组SCLC病人Kaplan-Meier生存曲线经log-rank和Breslow双重检验,有显著统计学意义（log-rank检验X²值=7.196,P=0.007;Breslow检验X²值=5.333,P=0.021）。12、Bcl-2蛋白,Fas蛋白表达阳性组与阴性组SCLC病人Kaplan-Meier生存曲线经log-rank和Breslow双重检验,无统计学意义。13、FasmRNA阳性表达的SCLC早期凋亡率为（3.037±0.216）%,FasmRNA阴性表达早期凋亡率为（2.544±0.341）%,两者比较差异有显著性（t=3.321,p＜0.01）。14、FasmLRNA阳性表达SCLC早期凋亡率为（2.382±0.356）%,FasL mRNA阴性表达SCLC早期凋亡率为（2.818±0.256）%,两者比较差异有显著性（t=2.607,p＜0.05）。结论1、FasmRNA及其编码蛋白在正常肺组织中高表达,而在SCLC中表达明显下调。2、FasLmRNA及其编码蛋白在正常肺组织中低表达,而在SCLC中高表达。3、FasLmRNA表达与SCLC淋巴结转移和生存时间有关,FasLmRNA阳性表达患者淋巴结转移机会增加,生存时间较阴性表达患者明显缩短。4、Bcl-2蛋白在正常肺组织中低表达,在SCLC中表达上调。5、FasmRNA阴性表达、FasLmRNA阳性表达与SCLC凋亡抑制有关。