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研究背景和目的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是特发性间质性肺炎中最常见的类型,病因不明,预后差,目前除肺移植外没有有效治疗方法。IPF被认为是环境风险因素和遗传易感性共同作用导致的疾病。鉴于遗传因素在IPF发病中的重要作用,明确与疾病表型有关的遗传易感变异有助于了解疾病的发病机制。高通量测序技术已在西方人群中发现了一些与IPF发病相关的易感遗传变异。但这些遗传变异不能解释所有IPF患者的发病机制,且部分已知变异存在种族分布差异,有必要寻找中国人群特征性的IPF遗传易感位点。本研究首先采用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)对10例中国汉族典型散发性IPF患者进行测序,筛选中国人群IPF患者的遗传易感位点,并在更大样本人群中进行鉴定,进而系统采用分子细胞生物学技术探索筛查确定的基因变异功能意义及其导致IPF发病风险增高的病理机制。材料和方法1.对10例中国汉族IPF患者外周血样本进行全外显子组测序,利用Sanger测序对WES结果进行确认,并结合生物信息学方法筛选出IPF易感变异。2.以Taqman探针法在881例间质性肺炎病人(包括214例IPF患者、224例非IPF的特发性间质性肺炎患者和443例结缔组织病相关性间质性肺炎患者)以及1090例健康对照者DNA样本中对筛选出的IPF易感位点EAF2 rs200859609进行变异基因型的对比筛查。在队列研究中分析rs200859609等位基因或基因型与间质性肺炎及其亚组发病风险的相关性。在分层分析中观察了年龄和性别是否影响了 rs200859609 对 IPF 的发病风险。用 Kaplan-Meier 检验分析了 rs200859609不同基因型的生存差异。3.利用免疫组化的方法观察EAF2在IPF患者肺组织及正常肺组织中的定位和表达情况,利用小RNA干扰和EAF2过表达载体调控肺泡上皮细胞A549的EAF2表达,利用细胞免疫荧光和Western blot方法观察EAF2对肺泡上皮细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及 TGF-β/smad 和Wnt/β-catenin通路的影响。结果1.我们运用全外显子组测序进行初步筛查,采用Sanger测序对初筛检出变异进行确认,同时结合生物信息学分析对检出变异进行相关筛选,发现位于EAF2基因Exon5的单碱基变异rs200859609(c.620C>T,p.S207F)将损害EAF2编码蛋白的功能,可能与IPF遗传易感性有关。2.队列分析显示,在中国人群中EAF2 rs200859609变异T等位基因显著增加了 IPF的发病风险。进一步分层分析提示,携带rs200859609 CT基因型的年龄较低(≤65岁)的男性IPF发病风险更高。生存分析显示,rs200859609次要等位基因可增加IPF患者的预后风险。3.EAF2主要表达于肺组织中的支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞内,在IPF患者肺组织内的表达明显低于正常肺组织。EAF2对肺泡上皮细胞A549的EMT具有抑制作用。除了抑制肺泡上皮细胞的Wnt1、Wnt10表达外,EAF2可能通过其它方式抑制TGF-β/smad与Wnt/β-catenin信号通路,发挥抑制EMT的作用。因此,EAF2的功能性变异将导致Wnt/β-catenin和TGF-β/smad活性增高,这可能是EAF2 rs200859609变异与IPF发病风险相关的病理机制。结论我们在全基因外显子水平上,发现并鉴定了 IPF易感位点EAF2rs200859609,并证明EAF2可能在肺纤维化过程中发挥抑制EMT的作用,为阐明IPF的发病机制和寻找潜在的治疗靶点提供了一定的实验依据。