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第一部分MSC移植对急性肺损伤小鼠肺部树突状细胞免疫调控的研究目的评价小鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植对急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）小鼠肺部树突状细胞（Dendritic cells,DCs）功能的影响,并探讨相关机制。方法细胞实验:（1）提取小鼠骨髓来源单个核细胞,使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4诱导为不成熟DCs,CD11c磁珠分选使其纯化后,使用不同LPS浓度（0、10、50、100、200、500和1000 ng/mL）和不同持续时间（24小时和48小时）对不成熟DCs进行刺激,通过流式细胞术分析细胞表型,明确LPS刺激DCs成熟的最佳时间及浓度。（2）成熟DCs（Mature DCs,mDCs）与MSCs通过Transwell共培养3天,通过流式检测所诱导的调节性DCs（regulatory DCs,DCregs）表型,评估MSCs对DCs多种共刺激分子及抗原递呈分子表达的影响。（3）流式检测DCs的程序性死亡配体（Programmed death ligand 1,PD-L1）表达,间接评估DCregs对T细胞增殖的影响。（4）流式检测DCregs对淋巴细胞刺激增殖作用。动物实验:（1）通过气道内注射LPS建立ALI小鼠模型,检测造模后0、1、2、4、6、12和24小时后肺部CD11b中CD11c阳性的经典树突状细胞（classical dendritic cells,cDCs或CD11c+CD11b+DCs）数量及其成熟度（MHCⅡ+cDCs、CD86+cDCs）变化,并与肺病理损伤评分的进行相关性分析。（2）根据ALI建模后不同时间肺部DCs数量及成熟度,选择合适时间点给予ALI小鼠移植MSCs治疗,流式检测MSCs治疗后肺部成熟DCs表型变化及CD4+T细胞数量及活化比率（CD44+或CD69+的CD4+T细胞）。（3）HE染色行肺组织病理学检查并进行肺损伤评分以评价肺损伤严重程度;检测肺湿重/体重比（LWW/BW）评价肺水肿程度。（4）移植DCregs治疗ALI,检测肺部组织病理、肺部T细胞数量及活化指标,评估DCregs治疗对ALI小鼠肺部CD4+T细胞及肺损伤影响。（5）将羧化荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）标记的 DCs 移植入 ALI 小鼠,然后给予MSCs治疗,通过流式细胞术检测肺部及血液中CFSE+CD11c+DCs,明确MSCs降低肺部DCs数量的原因。结果:1.细胞实验:（1）50 ng/mLLPS刺激不成熟DCs 24小时可成功诱导出较高成熟度的DCs。形态上DCs呈典型的周围面纱样及树突样改变,磁珠分选后其纯度达90%以上。LPS能够刺激不成熟DCs向成熟DCs分化,50ng/mLLPS能明显提高DCs成熟比率（P<0.05）,继续提高浓度,成熟程度改变不明显（P>0.05）;50ng/mLLPS在0h到24小时刺激DCs,DCs成熟程度明显提高（P<0.05）;刺激时间在24小时到48小时,DCs成熟比率未再明显提高（P>0.05）。（2）通过Transwell共培养3天,MSCs诱导出低表达MHCⅡ、CD86、CD40,高表达PD-L1的DCregs。相对于成熟DCs,与MSCs共培养后的DCs中MHCⅡ、CD86、CD40阳性细胞比率明显下降（P<0.05）,进一步检测DCregs中免疫耐受分子PD-L1阳性细胞的表达,发现DCregs中PD-L1+DCs的比率较成熟DCs明显升高（P<0.05）。（3）MSCs抑制了DCs对淋巴细胞的刺激增殖作用。MSCs通过旁分泌效应诱导后的DCs,刺激淋巴细胞增殖比率明显降低（P<0.05）。2.动物实验:（1）ALI发生2小时后,小鼠肺部DCs数量及成熟比率显著增高。相对于对照组,气道内滴入LPS后2小时肺部DCs数量明显增加（P<0.05）,随时间逐渐延长,12小时后不再持续增加;ALI建模2小时后成熟度也明显增高（P<0.05）,肺病理损伤显著,之后肺损伤随着时间延长而加重（P<0.05）;相关性分析显示:ALI时募集于肺部DCs的数量、DCs的成熟程度与肺损伤评分呈正相关（P<0.05）。（2）MSCs抑制DCs的肺部募集并降低成熟DCs的比率。ALI造模24小时肺部cDCs（CD11c+CD11b+DCs）的比率升高,且MHCⅡ+cDCs和CD86+cDCs比率亦升高显著（P<0.05）,MSCs治疗后肺部cDCs的比率以及MHCⅡ+cDCs比率下降（P<0.05）。（3）MSCs抑制肺部T细胞活化。气道内注射LPS 24小时后,肺部CD4+T细胞以及CD69+的CD4+T细胞的比率升高（P<0.05）,MSCs治疗后肺部CD4+T细胞比率有下降趋势,而活化的T细胞（CD69+的CD4+T细胞）的比率下降显著（P<0.05）。（4）MSCs治疗改善ALI小鼠肺病理损伤,并减轻肺水肿。与对照组比较,ALI组肺部病理损伤加重,肺损伤评分以及LWW/BW明显升高（P<0.05）;与ALI组相比,MSCs治疗后肺病理损伤减轻,肺损伤评分以及LWW/BW明显降低（P<0.05）。（5）移植DCregs抑制ALI小鼠肺部CD4+T的活化并减轻肺损伤。与ALI组比较,给予DCregs治疗后肺部病理损伤减轻、损伤评分降低,肺部CD4+CD44+T细胞、CD4+CD69+的T细胞比率下降（P<0.05）;而给予成熟DCs治疗后,ALI小鼠肺病理损伤更重,肺部CD4+CD44+T细胞、CD4+CD69+的T细胞增加（P<0.05）。（6）MSCs降低ALI小鼠肺及血液DCs的比率。ALI发生24小时时,外周血及肺中标记CFSE+CD11c+DCs比率明显增多（P<0.05）,在MSCs治疗后二者均减少（P<0.05）。结论MSCs可通过诱导成熟DCs分化为免疫耐受性DCregs,降低ALI肺部DC数量,并抑制CD4+T细胞增殖活化,减轻肺病理损伤。第二部分MSC通过旁分泌肝细胞生长因子调控树突状细胞免疫耐受的机制研究目的明确旁分泌肝细胞生长因子及激活Akt通路在MSCs诱导树突状细胞免疫耐受中的作用。方法（1）使用不同浓度的重组 HGF（Recombinant hepatocyte growth factor,rhHGF）（0、10、50、100、150和200 ng/mL）,对磁珠分选纯化后并被LPS刺激成熟DCs进行诱导72小时,然后流式检测DCs表型,明确rhHGF诱导DCregs最佳浓度。（2）MSCs或rhHGF与成熟DCs通过Transwell共培养72小时后,通过①流式细胞术检测DCs表型、吞噬功能、刺激淋巴细胞增殖能力、PD-L1和IL-27表达。②免疫荧光检测DC的吞噬OVA-FITC的功能。③ELISA检测DCs分泌炎症因子IL-10、IL-12和TGF-β的水平。④Western blot检测HGF下游通路蛋白c-Met和磷酸化c-Met表达。（3）构建小鼠高表达HGF和低表达HGF慢病毒载体,转入MSCs,分别上调和下调HGF RNA表达。①利用荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白的表达;②流式检测FITC-EGFP+MSC百分比评估转染率;③使用qRT-PCR法检测HGF mRNA水平:(④使用Western blot检测HGF蛋白水平;⑤使用ELISA检测MSCs旁分泌HGF水平。（4）使用高、低表达HGF的MSCs与成熟DCs通过Transwell共培养72小时后,检测DCs表型、吞噬功能、刺激淋巴细胞增殖能力、炎症因子IL-10、IL-12和TGF-β的分泌等。（5）使用Akt抑制剂MK2206阻断rhHGF对DCregs的诱导后,检测DCs表型、吞噬功能、刺激淋巴细胞增殖能力、分泌炎症因子IL-10、IL-12和TGF-β的水平等。结果（1）50 ng/mL rhHGF浓度可明显诱导成熟DCs分化为DCregs:当rhHGF从0 ng/mL浓度逐步增长至50 ng/mL时,可明显诱导低表达MHCII、CD86和CD40分子的DCregs生成（P<0.05）,继续增加浓度,表型改变不显著。（2）rhHGF或MSCs均可诱导mDCs分化DCregs:与MSCs或rhHGF共培养72小时后,mDCs分化为低表达MHCII、CD86、CD40的DCregs（P<0.05）,且生成的DCregs表型稳定。与mDCs 比较,MSCs或rhHGF诱导的DCs与不成熟DCs类似功能,吞噬能力明显增强,诱导的DCs刺激淋巴细胞增殖能力减弱,表达更多的PD-L1和IL-27,分泌更多的抑炎因子 IL-10、TGF-β,较少的促炎因子 IL-12（P均<0.05）。Western blot 显示 MSCs 或 rhHGF诱导的DCs,表达总c-Met蛋白无明显变化,但磷酸化c-Met蛋白表达明显增多。（3）慢病毒介导高表达以及干扰HGF的MSC中HGF RNA及蛋白表达:荧光显微镜显示转染后EGFP在MSCs中广泛表达,流式细胞术检测转染率高达93%以上。HGF高表达MSCs（HGF-MSC）的 HGF mRNA 约是对照组的 12 倍,干扰组 shHGF-MSCs 的 HGF mRNA是对照组的1/3。Western blot及ELISA显示高表达HGF-MSCs表达或分泌HGF明显增多（P<0.05）,而shHGF-MSCs表达或分泌HGF减少显著（P<0.05）。（4）HGF是MSCs诱导mDCs分化为DCregs的关键分子:与空载体组比较,HGF-MSC组的DCs中CD86、MHCⅡ阳性DCs 比率明显下降（P<0.05）,shHGF-MSC组的DCs中CD86、MHCⅡ阳性DCs 比率明显升高（P<0.05）。相对于空载体组MSCs,HGF-MSC组的DCs中吞噬功能增强（P<0.05）、刺激淋巴细胞增殖能力减弱（P<0.05）、分泌更多的抑炎因子IL-10、TGF-β及较少的促炎因子IL-12（P均<0.05）,而shHGF-MSC组的DCs吞噬功能减弱、刺激淋巴细胞增殖能力增强、抑炎因子IL-10、TGF-β分泌减少,促炎因子IL-12增加（P均<0.05）。（5）Akt通路参与MSCs诱导mDCs分化为DCregs:与对照组比较,HGF-MSC组的DCs表达总Akt蛋白无明显变化,但磷酸化Akt蛋白表达明显增多,而shHGF-MSC组的DCs表达总Akt蛋白无明显变化,但磷酸化Akt蛋白表达显著减少。（6）Akt通路是HGF诱导mDCs分化为DCregs关键通路:给予Akt抑制剂MK2206阻断Akt通路后,rhHGF所诱导的DCregs中MHCⅡ、CD40阳性DCs 比率明显增高（P<0.05）;抑制Akt通路后,rhHGF诱导的DCreg吞噬功能减弱（P<0.05）、刺激淋巴细胞增殖能力增强（P<0.05）、抑炎因子IL-10、TGF-β分泌减少、促炎因子IL-12分泌增加（P均<0.05）。结论MSCs通过旁分泌HGF并激活Akt通路诱导mDCs分化为具有免疫耐受功能的DCregs。第三部分高表达HGF的MSC移植对ALI小鼠肺部树突状细胞免疫调控的研究目的明确高表达HGF的MSCs移植对ALI小鼠肺部树突状细胞免疫调控的作用及肺损伤的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为Control组、ALI组、MSC组、NC-HGF-MSC组（HGF空载体-MSC 治疗组）、HGF-MSC 组（高表达 HGF 的 MSC 治疗组）、NC-shHGF-MSC 组（shHGF空载体-MSC治疗组）和shHGF-MSC组（低表达HGF的MSC治疗组）,气道内滴入LPS建立ALI小鼠动物模型,6小时后给予不同HGF表达的MSC进行治疗。为了评估MSC对DC迁移影响,将C57BL/6小鼠气道内注射CFSE标记肺内细胞,随机分组如上,随后构建ALI模型和给与不同的MSC治疗。为了评价Akt在HGF调控ALI小鼠肺部DCs功能中的作用,C57BL/6小鼠随机分为Control组、ALI组、rhHGF组、rhHGF+MK2206组。造模24小时后处死小鼠,检测上述各组的以下指标,评价旁分泌HGF及激活Akt通路在MSCs调控ALI肺部DCs功能中的作用:（1）留取右上肺叶制作石蜡切片,HE染色观察肺损伤程度并进行肺损伤评分;（2）计算肺湿重/体重比（LWW/BW）评价肺水肿程度;（3）制备肺单细胞悬液,流式检测肺部 cDCs（CD11c+CD11b+DCs）数量及其成熟度（MHCⅡ+cDCs、CD86+cDCs）变化;（4）流式检测肺部CD4+T细胞及其活化比率（CD69+的CD4+T细胞）。（5）制备支气管旁淋巴结（PBLN）单细胞悬液,流式检PBLN中CD11c+CFSE+DCs数量及其成熟度（CD86+的 CD11c+CFSE+DCs）变化;（6）留取肺泡灌洗液（Bronchoalveolarlavagefluid,BALF）,流式检测细胞总数。结果（1）高表达HGF能增强MSCs对ALI小鼠肺部DCs募集及成熟的抑制。ALI小鼠模型建立 24 小时,肺部 cDCs（CD11c+CD11b+DCs）的比率升高,且 MHCⅡ+cDCs 和 CD86+cDCs比率升高显著（P<0.05）,MSCs治疗后肺部cDCs的比率以及成熟的MHCⅡ+cDCs、CD86+cDCs比率下降（P<0.05）。与 NC-HGF-MSC 比较,HGF-MSC 组肺部 cDCs（CD11c+CD11b+DCs）的比率降低显著（P<0.05）,MHCⅡ+cDCs有下降趋势,CD86+cDCs 比率降低显著（P<0.05）;与 NC-shHGF-MSC 比较,shHGF-MSC 组肺部 cDCs（CD11c+CD11b+DCs）的比率显著升高（P<0.05）,MHCⅡ+cDCs 有上升趋势,CD86+cDCs 比率升高显著（P<0.05）。（2）高表达HGF增强MSCs对ALI小鼠肺部CD4+T细胞增殖及活化的抑制。ALI组较Control组小鼠肺部CD4+T细胞、CD69+的CD4+T细胞的比率升高以及肺部BALF中细胞总数量明显增高（P<0.05）,MSCs治疗后肺部CD4+T细胞、CD69+的CD4+T的比率降低以及肺部BALF中细胞总数量明显下降（P<0.05）。与NC-HGF-MSC治疗比较,HGF-MSC组肺部CD4+T细胞下降显显著（P<0.05）、CD69+的CD4+T的比率有下降趋势,肺部BALF中细胞总数量明显降低（P<0.05）;相对于NC-shHGF-MSC组,shHGF-MSC组肺部CD4+T细胞、CD69+的CD4+T的比率明显上升以及肺部BALF中细胞总数量明显增加（P<0.05）。（3）高表达HGF能促进MSCs减轻ALI小鼠肺组织病理损伤。①大体肺标本结果显示,气道内给予LPS 24小时后,小鼠肺呈现充血、水肿、出血改变;MSC组、NC-HGF-MSC与NC-shHGF-MSC组小鼠肺损伤无明显差异,但较ALI组小鼠肺损伤显著减轻,HGF-MSC组较NC-HGF-MSC组小鼠肺损伤程度减轻显著,HGF-shMSC组较NC-shHGF-MSC组小鼠肺炎症损伤程度明显加重。②组织病理结果显示,ALI建模24小时后,MSC、NC-HGF-MSC与NC-shHGF-MSC组小鼠肺组织病理损伤程度（水肿、肺泡和间质炎症炎性细胞浸润和出血、肺不张、坏死或透明膜形成）较ALI组明显减轻,HGF-MSC组较NC-HGF-MSC组小鼠肺组织病理损伤程度缓解显著;HGF-shMSC组较NC-shHGF-MSC组小鼠肺损伤程度则明显加重。肺组织病理损伤评分结果显示,MSC组较ALI组小鼠肺组织病理损伤评分以及LWW/BW较ALI组明显下降（P<0.05）;HGF-MSC组较NC-HGF-MSC组小鼠肺组织病理损伤评分以及LWW/BW降低显著（P<0.05）;shHGF-MSC组较NC-shHGF-MSC组小鼠肺组织病理损伤评分以及LWW/BW明显升高（P<0.05）。（4）高表达HGF减弱MSC对DC迁移的抑制,但促进DCregs的向支气管淋巴的迁移。ALI时肺内CD11c+CFSE+DCs向PBLN迁移增多,MSC治疗抑制了 CD11c+CFSE+DCs的迁移（P均<0.05）。相对于空载体组MSC,HGF-MSC促进了 CD11c+CFSE+DCs的迁移,而shHGF-MSC削弱了 DC迁移。进一步发现,HGF-MSC促进迁移的DC表达CD86水平下降（P<0.05）,这表明HGF-MSC治疗促进免疫调节型DCregs的迁移。（5）Akt抑制剂减弱HGF对ALI小鼠肺部DCs募集及成熟的抑制。rhHGF治疗后,ALI小鼠肺部cDCs（CD11c+CD11b+DCs）的比率显著降低（P<0.05）,且CD86+cDCs 比率亦下降显著（P<0.05）;给予Akt抑制剂后,肺部cDCs（CD11c+CD11b+DCs）有升高趋势。（6）Akt抑制剂减弱MSCs或HGF对ALI小鼠肺组织病理损伤保护作用。与ALI 比较,rhHGF治疗组肺部组织病理损伤减轻,组织病理损伤评分较ALI组明显下降（P<0.05）;LWW/BW有下降趋势。阻断Akt通路后,肺组织病理损伤评分有上升趋势。结论高表达HGF可显著增强MSCs对ALI肺部DCs免疫调控能力,降低肺部DCs的数量,诱导DCreg的生成,并促进DCregs向淋巴结迁移,抑制CD4+T细胞活化,减轻肺炎症损伤。