目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病严重的微血管并发症,而肾小球硬化是DN主要病理特征。肾小球足细胞损伤是DN早期事件之一,各种病因导致足细胞足突融合、进而引起足细胞凋亡和脱落、最终导致肾小球滤过屏障完整性受损和蛋白尿生成。足细胞胰岛素抵抗是DN肾组织病理损伤的重要启动因素之一。近年来,G蛋白偶联受体43（G-protein-coupled receptor 43,GPR43）在调节能量代谢和胰岛素稳态中的作用引起广泛关注。但GPR43活化在DN足细胞胰岛素抵抗中的作用及其具体机制尚不清楚,深入探究GPR43在肾脏及足细胞中的作用以及调控机制,对于改善和延缓DN进展具有重要的临床意义。因此,本研究通过开展临床研究、制备糖尿病动物模型、GPR43基因敲除模型及体外足细胞培养模型,应用肠道菌群杀灭及菌群移植技术,拟从整体、细胞、分子水平探讨GPR43在DN肾组织中的表达及足细胞胰岛素抵抗中的作用;并进一步探讨肠道菌群失调对GPR43激活的影响;最后探讨GPR43活化介导DN足细胞损伤和胰岛素抵抗的分子机制。方法:第一部分:GPR43在糖尿病肾病肾组织中的表达规律为了阐明GPR43在DN肾组织中的表达规律,本研究首先以病理诊断明确的DN患者和糖尿病小鼠模型为研究对象,利用Western blotting和免疫荧光染色技术检测肾组织中GPR43的表达变化,并采用免疫荧光共染色进一步检测了足细胞特异性蛋白WT-1和p Akt的表达变化及共定位情况。第二部分:GPR43在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用利用体外足细胞培养模型,应用Real-time PCR、Western blotting等方法检测SCFAs受体（GPR43、GPR41和Oflr78）、足细胞特异蛋白和胞外基质蛋白（nephrin、collagen-1、α-SMA）的表达变化,分析不同浓度梯度乙酸和GPR43 si RNA作用后GPR43对足细胞结构和功能损伤的作用。第三部分:GPR43活化介导糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗利用体外培养的足细胞培养模型,应用Real-time PCR、Western blotting等方法检测胰岛素信号通路分子胰岛素受体β（insulin receptorβ,IR-β）、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1,IRS1）和p-Akt的表达变化,荧光酶标法检测2-脱氧葡萄糖摄取变化,免疫荧光染色检测GLUT4膜转位变化,采用不同浓度梯度乙酸和GPR43特异性抑制剂和GPR43 si RNA干预,分析GPR43活化在足细胞胰岛素抵抗中的作用。第四部分:GPR43基因敲除对糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗的作用一、GPR43基因敲除的构建与敲除效率观察采用CRISPR/Cas9技术构建全身性GPR43基因敲除小鼠,提取小鼠鼠尾DNA进行基因型鉴定,利用免疫荧光染色、Real-time PCR和Western blotting等方法验证GPR43基因敲除效率。二、糖尿病小鼠模型的构建通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）（50mg/kg体重）连续5天构建1型糖尿病小鼠模型,注射完成2周后,测定小鼠空腹血糖大于16.7mmol/L即为糖尿病小鼠模型构建成功。造模成功后将小鼠分为4组:对照组（Ctrl）;GPR43基因敲除组（GPR43 KO）;糖尿病（DM）和GPR43基因敲除+糖尿病组（GPR43 KO+DM）,分别于4、8和12周收集小鼠尿液,测定尿微量白蛋白与肌酐（albumin and creatinine ratio,ACR）比值,观察12周后处死小鼠,收集小鼠粪便、血液、尿液和肾组织等,用于肠道菌群结构分析、生化指标、尿ACR、肾组织病理学分析和目的蛋白表达检测。第五部分:肠道菌群杀灭和粪菌移植对糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗的作用一、糖尿病大鼠模型的构建采用单次腹腔注射STZ（100mg/kg体重）构建1型糖尿病大鼠模型。注射完成后2周测定大鼠空腹血糖大于16.7mmol/L即为糖尿病大鼠模型构建成功。二、肠道菌群杀灭对糖尿病大鼠肾损伤的影响糖尿病大鼠模型造模成功后,将大鼠分为3组:Ctrl组、DM组、糖尿病+抗生素组（DM+AB组）,其中DM组大鼠的饮用水中添加以下5种抗菌素制成的抗生素混合溶液,各抗生素终浓度分别为氨苄青霉素1g/L、新霉素1g/L、万古霉素0.5g/L、甲硝唑1g/L和两性霉素B 1g/L。抗生素水溶液每日更换。观察8周后分别收集各组大鼠粪便、血清、尿液和肾组织标本,用于肠道菌群结构分析、生化指标、尿ACR、肾组织病理学分析和目的蛋白表达检测。三、观察粪菌移植（fecal microbiota transplantation,FMT）对糖尿病大鼠肾损伤的影响糖尿病大鼠模型造模成功后,将大鼠分为3组:Ctrl组、DM组、糖尿病+粪菌移植组（DM+FMT）组,其中,DM+FMT组大鼠给予移植来自对照组大鼠的粪菌。将对照组大鼠粪便置于预冷的含10%甘油的无菌PBS溶液中,制成混悬液后经导管缓慢灌入糖尿病大鼠胃内,Ctrl和DM组大鼠给予含10%甘油的无菌PBS溶液灌胃。灌胃后第3天收集大鼠粪便,对粪便中菌群结构进行16S r DNA测序,评估糖尿病大鼠接受正常粪菌移植后肠道菌群结构组成和丰度。观察8周后分别收集各组大鼠粪便、血清、尿液和肾组织标本,用于肠道菌群结构分析、生化指标、尿ACR、肾组织病理学分析和目的蛋白表达检测。上述动物实验中,采用临床生化检测法检测血糖、BUN和SCr等指标,ELISA试剂盒检测尿微量白蛋白水平。气相色谱法检测血浆乙酸水平。PAS染色观察肾脏病理损伤。透射电镜观察肾小球超微结构改变。免疫荧光染色、Real-time PCR、Western blotting等方法检测肾组织GPR43、足细胞特异蛋白nephrin、胞外基质蛋白collagen I和fibronetin、胰岛素通路分子等蛋白的表达变化。应用16S r DNA测序分析肠道菌群多样性改变。第六部分:GPR43激活介导糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗的作用机制1.AMP依赖的蛋白激酶α（Adenosine 5‘-monophosphate（AMP）-activated protein kinaseα,AMPKα）活性下降介导GPR43足细胞胰岛素抵抗利用Western blotting检测体内GPR43基因敲除、体外足细胞GPR43敲降对足细胞AMPKα磷酸化的表达影响。Western blotting检测AMPK激动剂AICAR对乙酸降低Akt磷酸化表达的抑制作用。2.蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）-磷脂酶C（phospholipase C,PLC）参与调控GPR43介导的AMPKα活性抑制和足细胞胰岛素抵抗利用Western blotting检测PKC抑制剂Go 6983和PLC抑制剂U73122对足细胞中GPR43活化介导的Akt磷酸化的影响。结果一、糖尿病背景下肾组织GPR43蛋白表达升高利用人DN肾活检组织和STZ诱导糖尿病大鼠模型证实,糖尿病背景下肾皮质中GPR43蛋白表达升高,并且随着DN患者肾脏病理损伤加重肾小球足细胞中Akt的磷酸化水平显著降低,提示GPR43蛋白的表达增加与Akt磷酸化水平的降低密切相关。二、乙酸促进GPR43活化和足细胞损伤体外研究证实,乙酸刺激足细胞GPR43基因和蛋白表达上调,抑制足细胞特异蛋白nephrin的表达,并促进胞外基质α-SMA和collagen I的生成,而这些效应在GPR43特异性si RNA作用后显著减弱。三、乙酸通过介导GPR43活化促进足细胞胰岛素抵抗进一步研究发现,GPR43活化抑制足细胞的葡萄糖吸收、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）转位和胰岛素信号。乙酸抑制Akt蛋白丝氨酸473位点发生磷酸化,进而抑制PI3K/Akt信号。此外,在高糖刺激背景下,乙酸抑制IRS1和IRβ的基因和蛋白表达。乙酸破坏胰岛素诱导的GLUT4向细胞膜的转移。GPR43拮抗剂GLPG0974和GPR43 si RNA部分逆转了乙酸对Akt磷酸化的抑制效应。四、GPR43缺失减轻糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗在此基础上,应用GPR43基因敲除模型证实,GPR43基因缺失不影响糖尿病小鼠肾组织GPR41和Oflr78的基因表达水平。与Ctrl组小鼠相比,GPR43-KO小鼠肾皮质中GPR43的蛋白水平显著降低,而DM组小鼠肾组织GPR43表达显著升高。与DM组小鼠比较,GPR43-KO的DM组小鼠GPR43表达显著降低。GPR43基因缺失不影响正常小鼠的肝肾功能。与Ctrl组小鼠相比,DM组和GPR43 KO+DM两组小鼠空腹血糖水平均显著升高,但两组比较无显著差异。DM和GPR43 KO+DM这2组小鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）和血肌酐（serum creatinine,Scr）水平无显著差异。与Ctrl组小鼠相比,DM小鼠肾重/体重显著升高,8和12周时的蛋白尿水平显著升高,系膜基质增多,系膜区扩张,肾组织内促纤维化细胞因子fibronectin和collagen I的基因和蛋白表达显著升高,足细胞特异性蛋白WT-1的表达显著降低,足细胞足突融合,肾小球基底膜增厚,足细胞WT-1和p Akt共定位明显减少。而以上特征在GPR43缺失的DM小鼠体内得到有效改善。主成分分析(principal components analysis,PCA结果提示,Ctrl和GPR43 KO两组小鼠粪便菌群组成相似,而DM和GPR43 KO+DM两组小鼠粪便菌群组成相似。五、肠道菌群杀灭和粪菌移植能够改善糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗应用抗生素杀灭肠道菌群,以及将对照组大鼠粪菌移植至糖尿病大鼠,则其血浆乙酸和肾组织GPR43表达水平随之降低。与Ctrl组相比,DM组大鼠24小时尿蛋白显著升高,肾小球内可见轻度系膜基质增生,足细胞特异性蛋白WT-1表达下降,p-Akt蛋白表达显著减弱;而应用抗生素干预或正常粪菌移植后,DM+AB组和DM+FMT组大鼠尿蛋白含量降低、系膜基质扩张减少和足细胞损伤减轻。肾组织p-Akt蛋白表达较DM组显著增强。六、GPR43通过PKC-PLC-AMPKα通路抑制胰岛素信号体外研究进一步证实,乙酸以浓度依赖的方式抑制AMPKα的磷酸化水平。而GPR43特异性si RNA阻断了乙酸的这一抑制作用。与DM小鼠相比,GPR43 KO+DM小鼠肾皮质AMPKα磷酸化水平增加。AMPK激动剂（AICAR）能够逆转GPR43活化对足细胞Akt磷酸化的抑制效应。PKC抑制剂Go 6983和PLC抑制剂U73122,均能够有效阻断足细胞中GPR43活化对Akt磷酸化的抑制作用。结论:1.GPR43在肾脏固有细胞中广泛表达。糖尿病肾病肾组织中GPR43表达显著升高,GPR43敲除后肾小球损伤明显减轻,蛋白尿情况得到改善,提示GPR43在糖尿病肾病进展中可能发挥重要作用。2.足细胞中GPR43表达增高呈现乙酸浓度依赖性,同时伴随Nephrin表达降低;GPR43激活后胰岛素信号通路的水平降低,GLUT4转位减少以及糖摄取量降低,提示GPR43活化参与了足细胞胰岛素抵抗。3.GPR43基因敲除糖尿病小鼠肾组织及高糖背景下GPR43基因沉默的足细胞中AMPKα磷酸化显著改善,提示GPR43可能通过调控AMPK活性介导糖尿病肾病足细胞胰岛素抵抗的发生。