论文部分内容阅读
原始生殖细胞(Primodial germ cells,PGCs)作为配子的前体细胞,负责将遗传信息传递给下一代。将分离的PGCs经过体外培养扩增以及转基因修饰后,移植到受体胚内能产生生殖系嵌合体,这是生产转基因禽类的一个理想途径。但在实际的研究操作中,由于对PGCs迁移和归巢性腺知识的缺乏,转基因嵌合体的制备方法没有优化,成功效率非常低。本研究旨在探索PGCs在注射到受体胚胎后的迁移机制以及影响其迁移效率的因素,为提高转基因鸡的生产效率提供一定的依据。首先,我们从广西黄羽鸡(yellow feather chicken,YF chicken) 13-15期鸡胚血液中分离PGCs进行体外培养扩增,经转基因修饰后,对获得的能稳定遗传的GFP-PGCs进行鉴定。结果发现,经过体外培养及转基因修饰的PGCs, SSEA-1染色呈阳性,RT-PCR分析结果显示这些PGCs表达了Dazl、Cvh、PouV、Cdh、Nanog基因,说明了我们获得的GFP-PGCs细胞株仍保留其生物学特性。随后,我们将鸡胚随机分成4组,分别孵育50h、55h、60h、65h后移植GFP-PGCs,探索受体胚龄对PGCs迁移的影响。结果发现,受体鸡胚孵育50h移植PGCs的迁移效率较孵育55h、60h、65h组高,孵育时间越长移植PGCs迁移效率越低。在探究移植细胞数对PGCs迁移的影响试验中,鸡胚随机分成四组,孵育50h后分别注射1000、3000、10000、30000个GFP-PGCs,结果显示,移植的最优细胞数为10000个／胚,移植的PGCs少于10000个／胚时,随着移植细胞数的增加,迁移的PGCs增加,当移植的PGCs多于10000个／胚时,迁移的PGCs不再增加。我们将移植10000个PGCs的鸡胚孵出,出壳4d小鸡睾丸内发现外源GFP-PGCs,证明了外源GFP-PGCs能在受体性腺内生长增殖。随后,成熟雄性嵌合体鸡精液DNA PCR结果显示,4个假定嵌合体中有1个呈GFP阳性。最后,我们探究了CXCR4信号通路在PGCs迁移过程中的作用。RT-PCR结果显示,PGCs表达了趋化因子受体Cxcr4基因。此外,我们在移植的细胞滴中分别添加CXCR4信号通路抑制剂AMD3100和WZ811, AMD3100浓度为OnM、10nM、50nM, WZ811为OnM、1nM、2nM,试验结果表明,50nMAMD3100以及1nM、 2nM WZ811能明显抑制PGCs的迁移(P<0.05)。证明了SDF-1/CXCR4信号通路参与调控PGCs在早期鸡胚中的迁移和归巢。综上所述,广西黄羽鸡PGCs能在体外长期培养,经转基因修饰后仍保留其生物学特性。受体鸡胚孵育50h为最佳移植时间,每个鸡胚移植10000个PGCs迁移至性腺的PGCs最多,归巢至性腺的PGCs能在受体睾丸中正常增殖生长。SDF-1/CXCR4信号通路参与介导PGCs的体内迁移过程。