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目的:人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)已被证实是子宫颈癌及癌前病变发生的首要因素且为始动因素[1],通过疫苗的方法来治疗和预防宫颈癌是目前研究的主要方向。本研究通过将点突变失去转化活性的HPV16、18、58mE6E7融合基因片段插入腺病毒(Adenovirus,AdV)表达载体,构建表达HPV16、18、58mE6E7融合基因的腺病毒载体疫苗,同时将含HPV58E6E7融合基因的慢病毒(Lentivirus,LV)转染小鼠宫颈癌U14细胞,构建稳定表达HPV58E6E7融合基因的U14细胞系,最后在表达HPV58E6E7融合基因的荷瘤小鼠模型中初步检测AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗对HPV58型相关肿瘤的免疫效果,为宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗提供候选疫苗。方法:1、点突变后HPV16型、18型、58型mE6E7融合基因片段的获得:通过GENEBANK网站,获得HPV16型、18型、58型的E6和E7基因序列,根据文献研究将E6和E7基因片段序列融合并去除终止码,同时将E6和E7基因通过关键碱基点突变失去转化活性改造成突变体mE6和mE7,使用双顺反子表达元件IRES连接,使其变成HPV16mE6E7-IRES-HPV18mE6E7-IRES-HPV58mE6E7(3480bp)融合基因片段,借助于公司对该片段进行全基因合成及测序,命名为pGH-HPV16/18/58mE6E7,并通过PCR及酶切实验验证目的片段。2、腺病毒载体疫苗AD-HPV16/18/58mE6E7的构建:将HPV16/18/58mE6E7基因片段连接入腺病毒表达载体,构建表达HPV16、18、58mE6E7融合基因腺病毒载体疫苗,通过RT-PCR、Western-Blot检测HPV16mE6E7、HPV18mE6E7、HPV58mE6E7融合基因在293A细胞中的转录翻译。3、稳定表达hpv58e6e7融合基因的小鼠子宫颈癌u14细胞系构建:将已构建成功的稳定表达hpv58e6e7融合基因的慢病毒转染小鼠子宫颈癌u14细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆,利用rt-pcr、western-blot分别检测hpv58e6e7融合基因在稳定转染的u14细胞株中的表达,并将稳定转染hpv58e6e7融合基因的u14细胞接种于c57bl/6小鼠右背部皮下成瘤,用rt-pcr、western-blot验证荷瘤小鼠模型瘤组织中hpv58e6e7融合基因的表达。4、疫苗免疫效果研究:用前期构建的ad-hpv16/18/58me6e7腺病毒载体疫苗免疫c57bl/6小鼠,进行预防及治疗hpv58e6e7(+)小鼠子宫颈癌细胞u14细胞移植瘤实验。通过对免疫后的u14/lv-hpv58e6e7荷瘤小鼠形态学、肿瘤生长情况、生存期等方面的观察以及血清抗体elisa、elispot、ctl杀伤等体液和细胞免疫方面的检测,初步评价该疫苗在抗hpv58型病毒及抗肿瘤方面的效果。结果:1、全基因合成了表达点突变后hpv16、18、58型me6e7的质粒pgh-hpv16/18/58me6e7,并通过基因测序、pcr及酶切实验鉴定目的基因片段;2、成功构建了腺病毒载体疫苗ad-hpv16/18/58me6e7,通过rt-pcr、western-blot验证其可以在293a细胞中转录翻译hpv16型、18型、58型me6e7融合基因;3、成功构建了稳定表达hpv58e6e7融合基因的小鼠子宫颈癌细胞u14细胞系,通过rt-pcr、western-blot验证其在体外、体内均可稳定表达hpv58e6e7基因。4、动物试验研究结果证实:经疫苗免疫后的小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫,在一定程度上抑制表达hpv58e6e7融合蛋白的小鼠子宫颈癌细胞u14细胞的生长,保护免疫小鼠免受移植瘤的攻击。1)在抗移植瘤保护实验中,疫苗组小鼠皮下的移植瘤成瘤潜伏期时间长于对照组,两组之间有统计学差异(p<0.05)。2)疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢,生存期较对照组延长,肿瘤平均瘤重明显低于对照组,抑瘤率明显高于对照组,实验组与对照组比较有统计学意义(p<0.05)。3)体液免疫血清特异性抗体检测elisa实验:经疫苗免疫的小鼠可诱发针对HPV58型E6、E7抗原表位肽蛋白的血清特异性抗体体液免疫,检测抗体滴度最高可达1:25600,与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。4)细胞免疫IFN-γ检测ELISPOT实验:可检测到通过HPV58型E6、E7抗原表位肽蛋白诱导的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞,疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数明显多于对照组,实验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。5)细胞毒性杀伤CTL实验:LDH法检测到AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗杀伤U14/LV-HPV58E6E7细胞的CTL反应最高达28%,说明其在一定程度上保护免疫小鼠免受U14/LV-HPV58E6E7细胞的攻击。结论:总之,成功构建并真核表达了AD-HPV16/18/58mE6E7重组腺病毒载体疫苗,并能在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫和细胞免疫,一定程度抑制HPV58E6E7(+)移植瘤的生长,具有免疫保护和免疫治疗作用,可以作为HPV58相关宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗的候选疫苗。