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研究背景和目的： 当前临床上应用于抗肿瘤的栓塞剂存在适应症狭窄、载药量小、成本高、介入途径困难等问题，我们计划设计一种新的多肽，即利用某一单克隆抗体的药物靶向性，加载促凝因子，有针对性性地、高效地诱发肿瘤血管血栓形成。基于这一研究思路，我们成功构建了融合蛋白tTF-EG3287的重组基因，EG3287是由外显子7和8编码的双环多肽， tTF是截短组织因子，具有激活外源性凝血反应；融合蛋白tTF-EG3287发挥抗肿瘤作用必须首先由载体分子EG3287准确定位到肿瘤血管内皮细胞，效应分子tTF诱发肿瘤血管血栓形成，导致肿瘤细胞缺血坏死，从而达到治疗目的。 实验方法： 重组质粒tTF-EG3287的构建及转化等步骤已在前期实验基础上完成。LB平板挑选高表达菌株后，过夜培养，然后以1∶100比例扩大培养，生长至对数期添加诱导剂IPTG，继续培养6-8h；统一收菌，由12%SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色对不同的蛋白表达量进行验证及比较；不断优化IPTG的诱导浓度及时间。超声破菌后，包涵体复合物经多次洗涤、离心再反复搅拌溶解后过镍柱纯化。蛋白复性在含梯度尿素的PBS系统中透析完成。 免疫荧光共聚焦法和血栓弹力图检测法检测蛋白活性。 构建结直肠癌移植瘤模型后，随机分组，每组5只，分别为Saline组（PBS）， tTF-EG3287治疗组和tTF治疗组，蛋白经荷瘤裸鼠尾静脉注射间断给药，每次给药前测瘤体积。 Cy5.5标记融合蛋白tTF-EG3287和tTF，经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内后，活体成像观察药物的生物学分布，24h后处死裸鼠，解剖分离瘤体和各组织器官，继续成像；病理切片HE染色，评价药物的靶向栓塞作用。 实验结果： 本实验纯化浓缩得到的融合蛋白tTF-EG3287浓度达2.1mg/mL，纯度＞85%，体外促凝活性及细胞靶向结合作用明显；在结肠癌荷瘤裸鼠实验中，连续治疗27d后，tTF-EG3287与tTF治疗组裸鼠移植瘤平均体积均小于Saline对照组，与对照组相比，tTF治疗组差异无显著差异，而tTF-EG3287治疗组差异有统计学意义（n=5,P＜0.01），tTF-EG3287的荷瘤裸鼠TGI（抑瘤率）为79.2%（n=5,P＜0.01），tTF的TGI为48.5%（n=5,P＞0.05）；活体成像实验中，tTF-EG3287能在荷瘤裸鼠体内靶向富集于肿瘤组织，在除肺外的其他正常组织器官富集很少，而tTF无特定靶向性；24h后器官成像显示tTF-EG3287能稳定、持久地靶向富集于肿瘤组织，而tTF在各脏器及肿瘤内几乎无富集；病理切片HE染色显示tTF-EG3287治疗组肿瘤血管内有混合血栓形成，而tTF治疗组的各器官未见明显缺血坏死灶，表现基本正常。 结论： 本实验优化了包涵体目的蛋白的纯化及活性鉴定等步骤；融合蛋白tTF-EG3287生物学作用稳定，在结直肠癌裸鼠移植瘤体内，能准确分布于癌组织，靶向栓塞肿瘤血管，抑制肿瘤细胞的生长。