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瞬时受体电位通道 M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)是一种Ca2+通透的非选择性阳离子通道,广泛分布于神经元,小胶质细胞,胰岛β细胞,单核细胞,巨噬细胞,内皮细胞等细胞当中。近年来研究表明,TRPM2通道参与了温度感知,炎症反应,缺血性损伤,神经退行性疾病,糖尿病,肿瘤等诸多生理病理过程。TRPM2通道的内源性配体主要为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的代谢产物腺苷二磷酸核糖(adenosine diphosphate ribose,ADPR)。同时,由于TRPM2通道能在H202的作用下被激活,因此也被认为是体内重要的氧化应激感受器。此外,Ca2+作为体内重要的信号分子,不仅可与ADPR协同激活TRPM2通道,还可以单独激活通道,但其具体门控机制还不清楚。为了探究TRPM2通道是否存在Ca2+结合位点,我们运用生物信息学方法预测出人类来源TRPM2通道(human TRPM2 channel,hTRPM2)氨基端存在两个潜在的EF-loop基序(D267-D278,D288-E298)。通过采用丙氨酸突变方法对这两个基序进行电生理功能检测,我们发现保守性较高位点的丙氨酸突变会显著影响通道电流(如D267A,D278A,D288A,E298A)。针对这些保守位点进一步的不同氨基酸突变功能检测发现,D267-D278基序内,D267位点的负电荷和D278位点的侧链对Ca2+激活hTRPM2通道非常关键。此外,G272R和G272I突变显著减小了hTRPM2通道的电流,提示G272位点侧链的加长会影响hTRPM2通道被Ca2+的激活。D288-E298基序内大部分位点突变会导致通道电流完全丧失,没有表现出仅有保守位点影响通道功能的特征。同时,表面生物素化表明,这些突变不影响通道膜运输。进一步的单通道记录结果提示,这些突变并非通过影响单通道电导引发通道电流变化。我们的数据提示,D267-D278基序可作为一段EF-loop,参与Ca2+对hTRPM2通道的激活,而D288-E298基序则不介导Ca2+结合。此外,我们先前通过比对不同物种TRPM2通道跨膜区序列,以及进一步比较TRPM2、TRPM4和TRPM5通道的跨膜区序列,发现它们在S2、S3跨膜片段区域(S2,S3 transmembrane segments domain,S2-S3 domain)存在一个潜在的 Ca2+结合位点。重要的是,最近的研究解析了海葵来源TRPM2通道(nematostella vectensis TRPM2 channel,nvTRPM2)结构,并发现其S2-S3 domain存在由谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸四个残基组成的Ca2+结合位点,但这些残基对TRPM2通道门控的影响并不清楚。我们运用分子突变和电生理检测的方法,系统探究了单位点突变对nvTRPM2通道和hTRPM2通道激活及失活过程的影响。我们的数据显示:1)E893A nvTRPM2几乎不能被激活,而E843A hTRPM2表现却与野生型一致;2)除电正性的赖氨酸突变外,谷氨酰胺位点的其余突变对通道激活影响较小,但它们加速了通道失活;3)天冬酰胺位点的丙氨酸及赖氨酸突变均使通道几乎不能被激活;天冬氨酸突变虽然不影响通道激活,却大大提高了通道的失活速率;4)天冬氨酸位点的各种突变均显著影响了 nvTRPM2通道及hTRPM2通道的激活过程。以上结果表明,四个位点中的电负性位点(谷氨酸和天冬氨酸位点)主要影响了通道激活,而不影响通道失活;电中性位点(谷氨酰胺和天冬酰胺位点)对通道激活影响相对较小,但却促进了通道失活。综上所述,本论文工作不仅在TRPM2通道氨基端鉴定出了 一个新型的对Ca2+激活TRPM2通道非常关键的EF-loop基序,也揭示了 Ca2+与TRPM2通道S2-S3 domain结合对通道激活及失活过程的影响,为Ca2+调控TRPM2通道门控过程提出了新机制。我们和其它课题组的研究结果,充分表明了 Ca2+调节TRPM2通道的门控过程十分精细复杂,为理解TRPM2通道介导的不同生理病理过程的分子机制提供了新的思路和实验依据。