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[研究背景]氩氦冷冻消融术后滞留于原位的坏死肿瘤组织,可为体内负载抗肿瘤树突状细胞(dendritic cells, DCs)疫苗提供肿瘤抗原。已有研究发现肿瘤冷冻术后,在瘤体内注射DCs可加强机体的抗肿瘤免疫反应并延长生存时间。氩氦冷冻消融术后肿瘤局部分成三个不同的区域,即中心坏死区、周边损伤区及冻融区外正常组织。DCs注射位点的选择应兼顾靠近抗原释放区域并利于归巢两个因素。将DCs注射于哪一区域治疗效果更好,尚无相关报道。本研究的第一部分将筛选DCs的最佳给药部位及免疫佐剂CpG-ODN对DCs归巢的影响。诱导DCs分化成熟是DCs疫苗制备中的关键环节,已有研究证实肿瘤冷冻治疗后,在瘤体内同时注射DCs及免疫佐剂较单独注射DCs效果更佳。但若要充分发挥DCs的抗原摄取功能,应在一定时间内维持DCs的未成熟状态,进而在合适的时机给予免疫佐剂刺激其成熟。目前,尚未见关于免疫佐剂给药时机与治疗效果相关性及最佳给药时机的报道。本研究的第二部分将筛选免疫佐剂C pG-ODN的最佳给药时机。氩氦冷冻消融术主要用于晚期肺癌患者的治疗,而目前所使用的晚期肺癌动物模型制备方法不一,可控性及可比性较差。本研究第三部分利用细胞团技术制备了瘤体、转移及瘤细胞数目等均可控性较强的小鼠晚期非小细胞肺(non-small cell lung cancer, NSCLC)癌模型,并运用该模型探讨了氩氦冷冻消融术联合体内负载DCs疫苗对晚期NSCLC的治疗效果。第一部分不同给药部位及免疫佐剂CpG-ODN对DCs归巢的影响[目的]探讨氩氦冷冻消融术后DCs的不同给药部位及免疫佐剂CpG-ODN对DCs归巢的影响,筛选最佳DCs给药部位。[材料与方法]1、体外扩增培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs;2、CFSE荧光标记DCs;3、对荷瘤小鼠行氩氦冷冻消融治疗;4、冷冻术后,将小鼠按给药区域(中心区、周边区、冻融区外、对侧正常组织)随机分成4组,每组内再按注射DCs/DCs+CpG-ODN分成2个亚组;5、DCs/DCs+CpG-ODN注射后第1、3、7d流式细胞术(flowcytometry, FCM)检测引流淋巴结中CFSE阳性细胞率并进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1、第6d收集体外培养的DCs,细胞状态良好,数量可满足实验需求;2、CFSE标记的DCs呈绿色荧光,细胞状态良好;3、各组中CFSE阳性细胞率均呈先上升后下降的趋势,于第3d达到峰值;4、各组中,DCs+CpG-ODN亚组的CFSE阳性细胞率均高于DCs亚组;5、将各组第3d CFSE阳性细胞率(峰值)进行统计学分析,结果表明,冻融区外注射组CFSE阳性细胞率均高于其他各组(p<0.05)。第二部分CpG-ODN的给药时机对氩氮冷冻消融术后体内负载DCs疫苗的影响[目的]探讨CpG-ODN的给药时机对氩氮冷冻消融术后体内负载DCs疫苗的影响,并筛选最佳给药时机。[材料与方法]1、体外扩增培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs, FCM检测CD80.CD83.CD86分子;2、对C57BL/6小鼠Lewis肺腺癌模型进行氩氦冷冻消融治疗:3、按免疫佐剂CpG-ODN的给药时间,将120只荷瘤小鼠随机分成4组,每组30只。所有荷瘤小鼠均在氩氦冷冻消融术后于冻融区外注射DCs。随后,在DCs给药后不同时间点(6、1 2、24h)于同一位置注射CpG-ODN,同时注射DCs+CpG-ODN(Oh)作为对照组;4、每组1 0只小鼠用于观察生存时间,10只未经治疗的荷瘤鼠作为对照;5、治疗后第7d,每组10只小鼠用于检测血清中的细胞因子:IFN-γ,IL-12/IL-23p40,IL-4,IL-10,TNF-α:FCM检测血CD3+CD4+T及CD3+CD8+T淋巴细胞亚群:6、氩氦冷冻消融术4w后,每组取10只小鼠,于小鼠对侧肢体二次接种Lewis肺腺癌细胞;7、比较各组二次接种瘤动态生长状况;8、二次接种肿瘤细胞4w后,脱颈处死小鼠,取肺及脾脏,比较各组肺部肿瘤转移情况:LDH法检测小鼠脾淋巴细胞对Lewis肺腺癌细胞的体外杀伤作用。[结果]1、DCs培养第6天,FCM检测示DCs低表达CD80.CD83.CD86分子,说明DCs处于未成熟状态;2、Kaplan-Meier生存曲线显示4个治疗组(0h组、6h组、12h组及24h组)的生存率均高于未治疗组;12h组的生存率高于其他三个治疗组如<0.05);3、冷冻术后第7d,12h组血清IL-12、IFN-Y含量均高于其他三组(p<0.05);12h组的血清TNF-α含量高于Oh组和24h组(p<0.05);12h的血清TNF-α含量虽高于6h组,但其差异无统计学意义(p>0.05);12h组血清IL-4、IL-10含量低于0h组和24h组(p<0.05);12h组IL4、IL-10低于6h组,但其差异无统计学意义(p>0.05)。4、治疗后第7d,12h组的CD3+CD4+T与CD3+CD8+T比例均高于其他三组如<0.05);5、12h组二次接种肿瘤体积小于Oh组和24h组(p<0.05); 12h组肿瘤体积小于6h组,但其差异无统计学意义妇>0.05);6、12h组肺脏的重量最轻,但略高于正常组,二者差异无统计学意义如<0.05);12h组肺脏重量低于0h和24h组(p<0.05);与6h组相比,12h组肺脏重量偏低,但其差异无统计学意义(p>0.05);7、12h组脾淋巴细胞杀伤能力高于Oh组及24h组如<0.05);12h组脾淋巴细胞杀伤能力高于6h组,但其差异无统计学意义(p>0.05)。第三部分氮氮冷冻消融术联合体内负载的DCs疫苗对晚期NSCLC治疗效果的研究[目的]制备可控性较强小鼠晚期NSCLC模型;检测氩氦冷冻消融术联合体内负载的DCs疫苗这一综合治疗方案对晚期NSCLC的治疗效果。[材料与方法]1、Lewis肺腺癌细胞复苏、培养及传代,第三代细胞用于制备细胞团;2、将细胞团移植于小鼠双侧腹部皮下;3、细胞团移植后7d,小鼠用于实验。治疗前鼠尾静脉注射Lewis肺腺癌细胞模拟NSCLC晚期肿瘤细胞的播散状态:5、40只荷瘤小鼠随机分成2组:氩氦冷冻治疗组与综合治疗组(氩氦冷冻消融+DCs+CpG-ODN),每组20只,各组仅对右侧病灶进行治疗;6、每组8只小鼠用于观察生存时间;7、治疗后第1、2、4、8w测量左侧瘤体大小,比较两组间的差异;8、治疗后第1、2、4、8w取小鼠的肺组织,称重比较肺部转移情况。[结果]1、细胞团技术制备的晚期小鼠肺癌模型在瘤体大小、转移部位及播散瘤细胞数目等方面可控性均较强;2、综合治疗组小鼠生存率高于冷冻治疗组p<0.05)。其中综合治疗组的中位生存期为71.5d;冷冻治疗组的的中位生存期为49.0d;3、在各时间点,综合治疗组的肿瘤体积均小于冷冻治疗组p<0.05);4、在各时间点,综合治疗组肺脏重量均低于冷冻治疗组p<0.05)。[结论]1、氩氦冷冻消融术联合体内负载DCs疫苗可有效提高机体抗肿瘤免疫反应:2、给药部位可影响DCs的归巢,冻融区外(瘤周)为DCs最佳给药位点; 3、CpG-ODN可促进DCs的归巢;4、CpG-ODN的给药时机对治疗效果有影响,DCs给药后12h为CpG-ODN的最佳给药时机;5、与单纯氩氦冷冻消融治疗相比,该综合治疗方案对于晚期NSCLC的治疗更佳。可延长生存时间,延缓新发转移灶的形成,并降低已形成的转移灶的生长速度,但不能使已形成的转移灶缩小。