【摘 要】
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目的:利用动物实验方法,研究眼镜蛇毒口服后能否以活性蛋白形式吸收入血及眼镜蛇毒蛋白在消化道的分布情况;检测口服眼镜蛇毒及其层析分离组分对小鼠免疫功能的药理学作用,筛选出对免疫功能有增强作用的有效组分。为眼镜蛇毒的药物开发利用提供实验依据和理论基础。方法:(1)采用眼镜蛇毒灌胃的方式,检测眼镜蛇毒对小鼠的口服LD100,利用shotgun质谱技术检研究眼镜蛇毒蛋白入大鼠血液的情况,利用免疫组化检测眼
【基金项目】
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项目名称:眼镜蛇毒 NGF 通过信号通路诱导肝星状细胞凋亡的研究,项目合同编号:81360078,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2014.1-2017.12
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目的:利用动物实验方法,研究眼镜蛇毒口服后能否以活性蛋白形式吸收入血及眼镜蛇毒蛋白在消化道的分布情况;检测口服眼镜蛇毒及其层析分离组分对小鼠免疫功能的药理学作用,筛选出对免疫功能有增强作用的有效组分。为眼镜蛇毒的药物开发利用提供实验依据和理论基础。方法:(1)采用眼镜蛇毒灌胃的方式,检测眼镜蛇毒对小鼠的口服LD100,利用shotgun质谱技术检研究眼镜蛇毒蛋白入大鼠血液的情况,利用免疫组化检测眼镜蛇毒蛋白在大鼠胃肠道的分布。(2)利用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱层析分离眼镜蛇毒,并按各分离组分所占峰面积百分比分别给各组小鼠灌胃,分析眼镜蛇毒分离组分口服后产生的免疫学功能,免疫器官称重测定小鼠胸腺指数和脾脏指数,中性红法和碳粒廓清法检测小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能,鸡红细胞免疫法检测小鼠血清溶血素水平,脾淋巴细胞体外培养检测con A诱导的T细胞增殖反应和LPS诱导的B细胞增殖反应。(3)选用免疫活性强的一组眼镜蛇毒蛋白组分,进行初步口服毒性检测,然后以人参为阳性对照,分析该组分口服后对正常小鼠免疫调节作用,利用流式细胞技术测定小鼠外周血CD4+、CD8+细胞亚群的变化,ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ、IL-4的水平,荧光定量PCR检测眼镜蛇毒分离组分经消化道吸收对小鼠小肠组织中TLR4m RNA的表达情况。结果:(1)口服眼镜蛇毒400 mg/kg以上,小鼠的死亡率达到100%;眼镜蛇毒口服后1 h和口服后3 h的大鼠血浆中可检测出有5组蛋白质与眼镜蛇毒蛋白质数据库匹配;眼镜蛇毒进入消化道后,在大鼠胃、十二指肠、空肠、回肠组织均有分布,且进入消化道1 h时主要分布在十二指肠的黏膜下层和浆膜层,进入消化道3 h时主要分布在胃和十二指肠的黏膜下层。(2)眼镜蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱层析分离得到4个分离峰,第I峰约占总面积73.45%,第II峰约占总面积2.25%,第III峰约占总面积7.3%,第IV峰约占总面积17%。第I峰组分能明显提高小鼠血清溶血素水平、抑制T淋巴细胞增殖、促进B淋巴细胞增殖(P<0.05),其作用效果不同程度的低于眼镜蛇毒;第II峰组分能明显提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬率和吞噬系数(P0.05),还能明显提高小鼠血清溶血素水平、抑制T淋巴细胞增殖(P<0.05),但作用效果显著低于眼镜蛇毒(P<0.01);第III峰组分能明显提高小鼠胸腺指数(P<0.05)、显著性抑制T和B淋巴细胞增殖(P<0.01),在提高小鼠胸腺指数方面低于眼镜蛇毒,对B淋巴细胞增殖的作用效果与眼镜蛇毒相反,呈抑制作用;第IV峰组分能显著提高胸腺指数和脾脏指数、单核巨噬细胞的吞噬率和吞噬系数、血清溶血素水平、促进T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞增殖(P<0.01),在提高脾脏指数方面显著高于眼镜蛇毒(P0.05)。结论:眼镜蛇毒可以以活性蛋白的形式经消化道吸收入血,主要的可能吸收部位为胃和十二指肠。眼镜蛇毒分离组分经消化道吸收后对正常小鼠免疫功能有不同程度的影响,其中眼镜蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析分离得的第Ⅳ峰组分可明显增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能,对免疫调节有促进作用,且口服毒性低,具有潜在的药物开发前景。
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