凝胶劣化做为现阶段鱼糜加工过程中影响鱼糜制品品质的关键因素,抑制鱼糜凝胶劣化现象是鱼糜制品加工中的关键问题。鱼体中内源性蛋白酶对鱼肉中肌球蛋白重链的降解是凝胶劣化的根本原因,而外源性蛋白酶抑制剂的加入可以有效地抑制鱼糜中内源性蛋白酶的活性,增强鱼糜凝胶品质。本实验通过构建鱼糜凝胶劣化模型,发现随着内源性蛋白酶作用时间的增长,肌球蛋白重链随之减少,直至消失,蛋白质二级结构也由α-螺旋向β-折叠转变,蛋白质结构逐渐松散,锁水能力减弱,导致形成的鱼糜凝胶凝胶强度、持水力等指标出现了显著下滑的趋势。而猪血浆蛋白作为添加剂加入到鱼糜中,鱼糜凝胶强度、持水力、质构特性等指标均有显著提高,但是,添加猪血浆蛋白后,鱼糜凝胶的白度有所降低。因此需要对猪血浆中抑制鱼糜凝胶劣化的半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行分离鉴定以及纯化应用,以避免猪血浆中杂质成分的不利影响。经分离纯化得到的有效成分采用质谱鉴定确定为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C）。通过构建重组质粒pET21a-CST3,导入到大肠杆菌（E.coli）感受态细胞BL21中进行原核表达,经IPTG诱导表达、包涵体复性及组氨酸标签纯化得到具有抑制活性的重组Cystatin C,经验证其具有抑制组织蛋白酶L酶活能力,同时能够明显地增强鱼糜制品的凝胶强度。在对重组Cystatin C与半胱氨酸蛋白酶反应的作用机制进行分析中,等温滴定量热拟合结果显示二者发生放热反应,可以1:1结合,二者具有中等结合能力(解离常数Kd=1.384×10-5M),基于酶反应动力学的Lineweaver–Burk plot双倒数曲线分析米氏常数Km随抑制剂浓度的增加而增大,最大反应速率Vmax几乎不变,因此Cystatin C与蛋白酶之间的抑制类型为与蛋白质底物的竞争性抑制。在Cystatin C和半胱氨酸蛋白酶的结合过程中,随着抑制剂比例的增加,荧光强度峰值逐渐降低;蛋白酶二级结构β-折叠结构显著增加,α-螺旋、无规则卷曲含量有减少的趋势。通过同源建模及分子对接模拟,Cystatin C与组织蛋白酶L可以通过活性中心紧密结合且其主要分子间作用力为氢键。上述实验为猪血浆Cystatin C在鱼糜生产过程中抑制凝胶劣化现象的广泛应用奠定了理论基础。