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球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus，Bs)是一种从土壤中分离的革兰氏阳性、好氧、嗜温和形成芽胞的细菌。部分菌株能够产生杀蚊毒素，并因此被广泛应用于疾病媒介蚊虫的生物防治。到目前为止，从球形芽胞杆菌中共鉴定了7种杀蚊毒素。活性最强的二元毒素（binary toxin，BinA/BinB）和最近发现的新的二组分毒素Cry48Aa/Cry49Aa在芽胞形成过程中以晶体的形式存在，两种蛋白等摩尔比例混合对致倦库蚊的毒力最强。营养期形成的杀蚊毒素(Mtx1、Mtx2和Mtx3)由于产量较低，并且容易被胞内蛋白酶降解，因而对球形芽胞杆菌毒力的贡献较小。球形芽胞杆菌不能够利用葡萄糖等糖类物质，并且基因组高度保守。这些特性使得它成为一种独特的细菌受到人们的不断关注。但是，关于球形芽胞杆菌有毒菌株和无毒菌株的进化关系，以及毒素基因在种群中的进化还不清楚。 球形芽胞杆菌的进化模型和遗传分型一直是一个备受关注的领域。关于Bs遗传分型的几种分型方法，如DNA同源性分析，血清型分型，多位点酶切电泳分型，16SrRNA分析和毒素基因的PCR检测，它们主要被用于有毒球形芽胞杆菌的鉴定。所有这些方法提供的遗传信息非常有限，而且难以建立有毒株和无毒株之间的进化关系。为鉴定球形芽胞杆菌菌株和探讨其种群结构，我们运用多位点测序分型(multilocus sequence typing，MLST)对35株球形芽胞杆菌进行了分析，这是通过对六个染色体编码的持家基因进行测序分析来完成的，它们分别是:腺苷酸激酶基因(adenylate kinase，adk)、代谢控制蛋白A基因(catabolite control protein A，ccpA)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，pycA)、丝氨酸羟甲基转移酶(serinehydroxylmethyl transferase，glyA)、葡萄糖6磷酸激酶(glucose6-phosphate kinase，glcK)和甘油吸收有利蛋白(glycerol uptake facilitator protein，glpF)。为了更好地理解有毒株和无毒株等位基因多样性，我们对这些菌株的毒素基因进行了PCR检测，并对其毒力水平进行了生物测定。结果表明，二元毒素基因binA/binB和cry48Aa/cry49Aa总是存在于高毒或中毒Bs菌株中，而无毒或低毒菌株仅含有mtx基因或者不含有任何毒素基因。此外，具有相同MLST序列型(sequence type，ST)的Bs菌株具有相同的毒素基因分布。进一步序列分析表明，球形芽胞杆菌的有毒菌株属于一个克隆群，而无毒菌株之间以及无毒株和有毒株之间有很高的序列差异，并且能够明显和有毒株区分开来。 全基因组测序首次在球形芽胞杆菌C3-41中发现一个大质粒pBsph，它编码对蚊幼虫有毒杀作用的二元毒素BinA和BinB。种群结构分析发现，大质粒pBsph存在于部分高毒力的球形芽胞杆菌菌株中，因此研究该质粒的复制特性及其分离机制，对于进一步了解二元毒素毒素的进化及其在球形芽胞杆菌中的稳定遗传有十分重要的意义。本研究中，我们定位了一个质粒pBsph上一个2.4-kb的DNA片段为pBsph的最小复制子(minimal replicon，minireplicon)，它含有的一个操纵子编码两个复制所必需的蛋白，即TubR-Bs和TubZ-Bs。研究发现，TubR-Bs是tubRZ-Bs操纵子转录水平上的一个负调节因子，并且能够以一种协同的方式和tubR-Bs基因上游11个12-bp重复(tubC)所组成的复制起点特异性结合，这些重复被两个DNA间隔分成了三个区域（tubC-Ⅰ、tubC-Ⅱ和tubC-Ⅲ）。通过对TubR-Bs结合重复区域的缺失分析发现，TubR-Bs和这些重复的结合为质粒复制所必需。TubZ-Bs具有明显的GTP酶活性，并且能够和TubR-Bs∶DNA复合体结合形成三元核蛋白复合体。电镜和荧光显微观察发现，TubZ-Bs在体内和体外均能够形成丝状结构。TubZ-Bs的两个点突变(T114A和Y260A)严重影响了TubZ-Bs的GTP酶活性，以及蛋白在体内和体外的自组装活性，导致突变质粒不能够形成正常转化子。进一步研究发现，TubZ-Bs-GFP或其突变蛋白TubZ-Bs(T114A)-GFP和TubZ-Bs(Y260A)-GFP在Bs C3-41中的过表达导致pBsph的稳定性显著降低。综合上述结果，表明TubR-Bs和TubZ-Bs不仅为质粒复制所必须，而且对于质粒pBsph的分离也有重要作用。这些结果有助于我们理解TubZ系统的遗传特殊性。 分离稳定性数据表明，最小复制子是高度不稳定的，而野生型的pBsph质粒在球形芽胞杆菌中是高度稳定遗传的，表明大质粒上还存在其它的稳定性因子。但是，造成pBsph和其最小复制子稳定性差异的因子及其调控机制目前还不清楚。本研究中，我们发现tubZ-Bs基因下游的orf187基因（编码TubⅩ蛋白）对于复制子的稳定有一定帮助。同时，tubⅩ的缺失突变或过表达均导致pBsph稳定性和tubZ-Bs mRNA水平的显著降低，当用单拷贝的tubⅩ基因去回复tubⅩ突变时，pBsph的稳定性和tubZ-Bs的mRNA水平均有明显的回补。电泳迁移率阻滞试验(electrophoretic mobilityshift assay, EMSA)表明TubⅩ能够特异性地和tubRZ-Bs操纵子的启动子区域结合。DNaseⅠ足迹（DNaseⅠfootprinting）表明TubⅩ的结合位点由5个8-bp的重复序列组成，该重复区域刚好位于TubR-Bs结合的第一组(tubC-Ⅰ)和第二组(tubC-Ⅱ)重复区域之间。进一步研究发现，TubⅩ和tubRZ-Bs启动子的结合导致TubR-Bs和启动子内的第三组重复(tubC-Ⅲ)的结合不稳定，并且这样一种负影响不能够通过增加TubR-Bs的蛋白浓度而得到完全逆转。综合这些结果，我们首次提出了三型质粒分离系统的一个调控模型。在这个系统里面，TubR-Bs和上游DNA重复tubC结合，负调控分离操纵子的表达和形成TubRC核蛋白复合体。TubZ-Bs能够形成动态不稳定的丝状体，并且能够和TubRC相互作用形成三元质粒分离体，即TubZ质粒分离系统，它在质粒pBsph的分离和稳定中发挥重要作用。分离位点tubZ-Bs下游的tubⅩ基因编码TubⅩ蛋白，它通过正调控tubZ-Bs的表达来参与质粒pBsph的分离和稳定。TubⅩ对tubZ-Bs表达的正调控活性来源于TubⅩ和tubZ-Bs启动子的直接结合以及TubⅩ的结合对TubR-Bs介导的负调控活性的对抗作用。