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背景非小细胞肺癌是全球癌症死亡的主要原因。15%的肺癌患者可能在诊断初期就有恶性胸腔积液(malignant pleural effusions,MPE),一半的患者在后期会发展恶性胸腔积液。恶性胸腔积液是非小细胞肺癌患者预后不良的一个标志。尽管其治疗方式的较以前有了进展,但是恶性胸腔积液患者的中位生存期依然有限。恶性胸腔积液被认为是一种有利于非小细胞肺癌发展的特殊肿瘤微环境。然而,研究者关注更多关注的是原发肿瘤,对恶性胸腔积液发生发展的机制研究较匮乏。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种短(18-25nt)的非编码的内源性RNA,通过调控基因的表达发挥生物学功能,包括凋亡、分化和细胞增殖等。人类癌症中异常表达的miRNAs,参与调控肿瘤的发生与发展。因此,miRNAs可能成为肺癌诊断和预后的生物标志物。然而,到目前为止,还未发现可以作为非小细胞肺癌恶性胸腔积液临床预后标志物的miRNA。调节性T细胞(Treg)在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用。然而,肿瘤微环境中Treg细胞显著上调的具体机制还尚未明确,尤其是恶性胸腔积液中。研究表明,趋化因子CXCL1在肿瘤微环境中可以促进肿瘤的发生发展,但其在恶性胸腔积液微环境中具体的促肿瘤机制仍不完善。更重要的是,至今,miRNAs影响恶性胸腔积液发展的具体机制也未阐明。因此,有必要进一步揭示他们在恶性胸腔积液中的调控作用。研究内容免疫细胞、microRNA和细胞因子水平对肿瘤进程意义重大,肺癌胸腔积液是复杂的微环境,并且存在异常。针对肺癌胸腔积液微环境的的异常,我们分析肺癌胸腔积液中主要免疫细胞、microRNA以及细胞因子的变化；microRNA作为良好的生物标志物,可能成为肺癌诊断和预后的生物标志物,是否可以作为肺癌恶性胸腔积液临床预后标志物的；并进一步分析变化的细胞、细胞因子以及microRNA之间是否存在关联,是否会影响肺癌胸腔积液患者预后,进而阐明肺癌胸腔积液中microRNA及免疫细胞调控肺癌胸腔积液进展的相关机制。方法1.收集89例非小细胞肺癌患者的恶性胸腔积液及其外周血,另外收集44结核患者的良性胸腔积液、外周血和16例正常人外周血作为对照。分离积液与外周血中的淋巴细胞,流式细胞术检测上述样本中Treg、NK和Th17细胞的变化。2.收集184例非小细胞肺癌胸腔积液。挑选出10例预后不同的非小细胞肺癌胸腔积液样本,利用MiRNA芯片技术和生物信息学筛选出肺癌胸腔积液中差异表达的1niRNAs。在184例样本中(随机分成数目相等的实验组和验证组),利用Q-PCR验证筛选出的差异表达miRNAs,基于miRNAs表达模式进行风险评分,收集患者生存期等临床资料进行相关性分析。3.收集268例非小细胞肺癌患者的样本,有的已发展恶性胸腔积液。患者的肿瘤组织或恶性胸腔积液以及外周血纳入本实验。流式细胞术检测积液和外周血中Treg细胞的水平。利用人细胞因子抗体芯片(Proteome Profiler Array)初步筛选表达差异的细胞因子并用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)验证。qRT-PCR检测相关基因mRNA水平的表达量。通过荧光素酶报告系统验证miRNA与靶基因的作用位点。用细胞趋化性试验分析评价不同条件对Treg的趋化能力。构建动物模型说明：mRNA和细胞因子的抗肿瘤作用。结果1.非小细胞肺癌胸腔积液中Treg细胞显著高于患者外周血,高于结核对照组,远高于正常人外周血；肺癌胸腔积液患者中CD56dimCD16+NK细胞显著低于患者外周血和正常人外周血；Th17细胞在组间没有显著差异。2.在肺癌胸腔积液患者预后不同的两个组中初步筛选出33个差异表达的miRNAs,其差异表达倍数>2。miR-141和miR-93等在预后好的患者中显著性高表达,并且发现一组miRNAs (miRNA-93,miRNA-100,miRNA-134, miRNA-151和miRNA-345)的表达水平与病人生存期显著相关。在实验组和验证组中,高表达miR-100与低表达：niRNA-93,miRNA-134,miRNA-151和miRNA-345的MPE患者预后不良。根据miRNA的表达量对所有患者进行风险评分。与低风险评分的患者相比,高风险评分患者的预后较差。由IniRNA菱达水平得到的风险评分可作为独立预测患者预后的一个因子,且不依赖其他因素。3.非小细胞肺癌胸腔积液中Treg细胞的水平显著上调,且与患者的预后呈显著性负相关(P<0.001,R=-0.67)。非小细胞肺癌恶性胸腔积液中高水平的趋化因子CXCL1与Treg细胞显著相关(P<0.01,R=0.45)。miR-141可以调控肺癌细胞中CXCL1的表达和分泌,且双萤光素酶报告基因检测系统确认miR-141与CXCL1存在靶向关系。细胞趋化分析实验说明miR-141-CXCL1可以可以调控Treg细胞的迁移,且CXCR2参与其中。构建的肿瘤动物模型说明miR-141-CXCL1对Treg细胞的调控在体内也有潜在的抗肿瘤作用。结论非小细胞肺癌MPE是一种特殊的微环境,免疫细胞与肿瘤细胞共生于此。MPE中上调的Treg细胞,可能会抑制肿瘤抗原特异性T细胞的杀伤作用；下调的CD56dimCD16+ NK细胞,可能会导致天然免疫细胞毒杀伤力显著低于正常人外周。miRNAs表达模式在非小细胞肺癌胸腔积液中发生了系统性的变化。非小细胞肺癌胸腔积液中的一组miRNAs,可以用来预测肺癌患者的预后,有助于进一步研究晚期非小细胞肺癌的发展和靶向治疗策略。本研究揭示了niRNAs与MPE两者之间的关系,miR-141在MPE中低表达,标志着患者预后不良。其影响恶性胸腔积液预后的可能机制是：恶性胸腔积液中低表达miR-141的患者,积液内趋化因子CXCL1的分泌增多,通过CXCR2促进了Treg细胞在NSCLC恶性胸腔积液中的招募,促进了肺痛胸腔积液的讲展与恶化,不利于患者预后。