论文部分内容阅读
BIN蛋白家族包括BIN1、BIN2、BIN3三个成员,它们都含有一个保守的BAR(Bin/Amphiphsin/Rvs)结构域,该蛋白家族通过形成二聚体识别并改变膜曲率,形成囊泡。在哺乳动物体细胞中的研究表明,BIN蛋白家族主要存在于神经细胞的突触囊泡以及免疫细胞的细胞膜上。在神经细胞中,BIN家族负责调节囊泡内神经递质的释放以及突触对细胞外信息分子等的吸收。而在B细胞、T细胞等免疫细胞中,该类蛋白通过参与细胞伪足的形成来调节细胞的迁移和吞噬等作用。目前在小鼠卵母细胞中还没有BIN蛋白家族相关的报道,而我们的工作主要侧重研究该蛋白家族在卵母细胞发育过程中的作用。免疫荧光(IF,Immunofluorescence)及免疫印迹(WesternBlot)结果显示,与其它主要组织及颗粒细胞相比较,BAR家族中只有BIN2蛋白在卵母细胞内优势表达。因此我们重点研究了 BIN2蛋白对卵母细胞发育潜能的影响,并对其调控雌性生殖的作用机制进行了初步探讨。我们首先在小鼠卵母细胞中用新型多肽纳米颗粒(Nanoparticle)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)高效敲降Bin2。结果发现,与对照组相比,敲降组卵母细胞发育显著延迟且微绒毛密度明显减少。主要表现为:发育至8 h,敲降组MI率降低:发育至10 h,敲降组AI期染色体分离滞后;发育至16 h,敲降组MII期染色体聚集程度降低且排列异常。IVF(in vitro fertilization)实验显示敲降组出现低受精率和高多原核率。为此,我们用Bin2抗体进行免疫沉淀-质谱分析(IP-MS,Immunoprecipitation-Mass spectrometry),鉴定出多种与减数分裂及卵泡发育相关的蛋白及功能未知蛋白γ-catenin(又名JUP,junction plakoglobin)、Lck(lymphocyte protein tyrosine kinase)、PLK1(polo-like kinase 1)、LKB1(Lkb1 kinase)。通过查阅文献及免疫共沉淀(Co-IP,Co-Immunoprecipitation)的方法,我们初步确定了信号通路,其中BIN2分别与γ-catenin和Lck相互作用,且通过激活γ-catenin及下游的激酶(包括LKB1、PLK1)来调控减数分裂进程。Bin2敲降后发现γ-catenin和γ-catenin的磷酸化水平均未变化,说明可能存在其他的调节方式。据报道γ-catenin只有形成二聚体才有活性,故我们用辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS,Disuccinimidylsuberate)处理样品使蛋白交联后做BIN2IP后,发现在γ-catenin二聚体的位置条带明显加强。此实验结果表明BIN2可以促进γ-catenin二聚体的形成,从而激活BIN2下游蛋白,影响减数分裂相关进程。我们通过质谱-磷酸化分析-磷酸化位点鉴定,得到了 BIN2两个可能的磷酸化位点(Thr424和Ser425,其可能性高达99.8%),并制备了针对该位点的磷酸化抗体,通过RNA干扰及多狀封闭后Western Blot相应条带消失的方法验证了磷酸化抗体的有效性。卵母细胞免疫荧光的结果显示,BIN2和磷酸化BIN2都存在于细胞膜和纺锤体上,但是在细胞膜上BIN2明显多于磷酸化BIN2,而在纺锤体上磷酸化BIN2更多。因此,实验结果表明磷酸化为BIN2的非活性形式。综上所述,BIN2是在卵母细胞中高表达的蛋白,并对卵母细胞减数分裂和发育潜能具有重要调控功能。BIN2不是通过y-catenin的磷酸化来调节下游信号通路,而是通过γ-catenin的二聚化调控卵母细胞发育进而影响卵母细胞质量的。