一、PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白组学分析目的：通过高通量的质谱技术以及SILAC精确的计量技术,使蛋白组学能够应用于前列腺癌蛋白质组的系统分析,明确在肿瘤进程中有意义的蛋白指标。方法：使用精氨酸10、赖氨酸8标记的SILAC培养液对PTEN敲除小鼠前列腺癌细胞株进行培养。RIPA液对细胞进行裂解。正常组织、肿瘤标本的石蜡切片及小鼠前列腺癌细胞系提取蛋白,胰蛋白酶消化,肽链的分离及液相质谱分析,软件数据分析。结果：数据分析最终得到约2000种蛋白。其中肿瘤标本中明显上调蛋白占264种,明显下调蛋白303种。PTEN敲除标本中有关细胞粘附的蛋白表达上调(胶原蛋白、层粘连蛋白、整合素…)；有关蛋白质运输(RAB)上调；调节细胞周期的部分蛋白下调(MAPK7、胞裂蛋白及组蛋白),有关未折叠蛋白反应中的一系列基因下调。结论：利用SILAC技术的定量蛋白组学研究能够精确地对比肿瘤组织与正常组织之间的蛋白水平差异,能够更好地了解前列腺癌进展的分子生物学机制,为前列腺癌早期的生物学标志物的筛选、寻找有效地靶向治疗基因及对于前列腺癌治疗效果进行有效的监测建立了良好的基础。二、抑制PTEN表达后前列腺癌细胞22Rv1的变化目的：结合蛋白组学分析结果,PTEN基因的缺失可能会引起有关未折叠蛋白反应的基因的改变,从而对细胞的增殖与凋亡产生影响。目前PTEN与未折叠蛋白反应中有关凋亡的Chop基因之间的关系尚无有关报道。方法：实验采用前列腺癌细胞株22Rv1,首先利用siRNA干扰技术沉默22Rv1细胞中的PTEN基因。MTT检测22Rv1细胞沉默PTEN基因后的细胞活力。流式细胞仪检测细胞凋亡。使用realtimePCR技术检测未折叠蛋白反应中Chop基因,观察其随着PTEN基因沉默后的表达情况。利用WesternBlot检测蛋白表达情况。结果：抑制或沉默PTEN后前列腺癌细胞22Rv1的凋亡减少,细胞活力升高。westernBlot可见P-AKT473表达水平降低。Realtime PCR可见未折叠蛋白反应中的Chop基因mRNA水平下降,westernblot检测后可见Chop基因随PTEN的抑制而下调。结论：结合前期蛋白组学分析结果,抑制PTEN基因后可见未折叠蛋白反应中有关细胞凋亡的Chop基因下调,提示Chop基因可能在前列腺癌细胞的增殖及其凋亡中发挥作用。三、Chop基因对前列腺癌细胞生长和凋亡的影响目的：Chop,又称为gadd153(DNA损伤诱导转录因子3)是由于内质网在应激刺激下稳态失衡所诱导高表达的基因。我们研究表明随着PTEN的下调,Chop基因随之下调。chop基因的表达与细胞凋亡有关,但是chop基因在前列腺癌细胞中与细胞凋亡及增殖的关联还未被证实。方法：实验采用前列腺癌细胞株22Rv1,通过siRNA沉默22Rv1细胞中的Chop基因,MTT检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡。利用携带Chop基因的质粒转染进入22Rv1,48小时候利用WestemBlot检测蛋白表达情况。同时MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：1、抑制或沉默Chop基因后前列腺癌细胞22Rv1细胞凋亡减少、细胞活力增多。过表达Chop基因后可见细胞活力降低,细胞凋亡增加。2、过表达Chop基因后可见pAkt473、Ki67表达降低。结论：我们的数据显示抑制PTEN表达后chop基因表达减少,细胞凋亡随之减少,细胞活力升高。过表达Chop后细胞凋亡增多,细胞活力降低。随着Chop表达增多,pAkt473基因与Ki67基因表达显著下降。证明了在Chop基因可能是引起细胞凋亡过程中的一重要因素,通过降低pAkt473的表达水平,Chop基因能够促使细胞进入凋亡。同时,过表达Chop基因可见Ki67基因表达下调,推测Chop基因可能与细胞增殖有关。四、构建出可诱导表达c-myc基因的22Rv1细胞系。目的：Myc已知可直接或间接调节众多基因及途径的转录过程。本实验在此基础上结合可调控基因治疗的观念与手段,采用四环素诱导表达的载体系统,创建可诱导表达c-myc基因的22Rv1前列腺癌细胞系。方法：实验采用前列腺癌细胞株22Rv1,首先构建稳定转染的携带调节载体的22Rv1细胞系,然后转入携带c-myc基因的可调控表达载体,利用Blasticidin和Zeocin两种药物进行筛选,挑出单克隆并培养出稳定细胞系。结果：构建出可诱导表达c-myc基因的22Rv1细胞系。结论：本实验利用可调控基因治疗的观念与手段,采用四环素诱导表达的载体系统,构建出可诱导表达c-myc基因的22Rv1细胞系,为进一步研究致癌基因c-myc对于前列腺癌细胞的影响打下了良好的基础。