研究背景与目的 斑蝥素是中药斑蝥的提取物，具有抑制肿瘤细胞生长的作用，表现出抗肿瘤活性。但因其毒性较大，主要为泌尿和消化系统刺激症状，限制了其广泛应用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的去甲衍生物，其毒性大大减弱，而抗肿瘤活性与斑蝥素相似，目前被用于治疗肝脏肿瘤，慢性肝炎，以及白血病。但其具体作用机制还不清楚。NCTD可以诱导肿瘤细胞凋亡，这些肿瘤细胞包括K562，MCF，HeLa，T淋巴细胞白血病细胞株6T-CEM，以及肝癌细胞株BEL-7402等；既往的研究发现，NCTD可以抑制肿瘤细胞的DNA的复制，从而抑制肿瘤细胞的生长；近来研究证实NCTD可以抑制PP2A的活性，重新引起了人们对斑蝥素及其衍生物尤其是NCTD的关注。但是目前对于NCTD抗肿瘤作用的研究大多只是停留在现象的观察，对于其作用的分子机理研究不多，NCTD作用的确切靶点尚有待探讨。 在真核细胞中，DNA的复制受到精确的调控，一旦起始DNA复制，必须保证所有的DNA都被复制，而且在一次细胞周期中只复制一次。复制前复合体(prereplicationcomplex，Pre-RC)的形成和解体，在调控DNA的精确复制过程中发挥重要作用。DNA的复制需要在起始位点(Origin)组装形成Pre-RC，包括：ORC、Cdc6、Cdt1和MCM2-7，这些蛋白相继组装在Origin上一起构成pre-RC，pre-RC组装完成后，Origin便具备了起始DNA转录的能力。其中Cdc6蛋白对于完成pre-RC的组装至关重要，抑制Cdc6会阻碍DNA的合成；而过表达Cdc6会导致在一个细胞分裂周期内出现重复的DNA复制。但是Origin具备了起始转录的能力并不等于立即就可以开始转录，Origin的激活是以完成pre-RC到pre-IC组装的过渡为标志的，Cdc45被招募组装到Origin是完成pre-IC的标志，Cdc45对于激活起始DNA的复制具有至关重要的作用，Cdc45可作为一个桥梁，连接pre-RC与其他DNA复制所需要的蛋白。 一些实验证实在一些肿瘤细胞中Cdc6、Cdc45的表达比正常细胞偏高，这些蛋白因子对于肿瘤细胞的恶性增殖具有重要作用。最近有人提出Cdc6的异常表达具有癌基因的功能，可直接抑制INK4/ARF基因座位(编码抑癌基因p15INK4b，p16INK4a和ARF)促进细胞的恶性转化。DNA复制调节蛋白，尤其是Cdc6与肿瘤的关系越来越受到人们的关注。因其在DNA复制调节中的关键作用及肿瘤组织中的特异性增高，抑制其功能有可能在杀伤肿瘤细胞的同时而对正常细胞影响较小，Cdc6有可能成为一个有效的、特异性强的抗癌靶点。 本研究的目的是：明确NCTD对DNA复制起始蛋白的影响，进一步阐明NCTD的抗肿瘤作用机理；明确DNA复制起始蛋白作为靶点在肿瘤治疗中的意义。 方法及结果 (1)NCTD对肿瘤细胞的增殖抑制作用方法：采用MTT方法检测NCTD对HL-60、KB、Ramos、Jurkat、Lovo、CNE2、HepG2细胞的增殖抑制作用。 结果显示：NCTD对以上几种肿瘤细胞均有增殖抑制作用，显示出良好的抗肿瘤活性。对不同肿瘤细胞抑制作用强度有所差别，以对HL-60抑制作用较强.。IC50分别为：HL-60细胞42.46±0.49μM、Jurkat细胞62.46±0.63μM、HepG2细胞65.82±2.39μM、KB细胞74.09±1.45μM、Ramos细胞69.83±7.91μM、Lovo细胞130.4±21.8μM、CNE2细胞133.5±6.62μM。 (2)NCTD对HL-60细胞DNA复制的抑制作用方法：采用3H-TdR掺入抑制实验检测了NCTD对HL-60细胞DNA复制的影响。 结果显示：不同浓度的NCTD(0-128μM)作用于HL-60细胞12h后，其3H-TdR掺入量明显降低。未加药处理组c.p.m.值为13402±194.21；加药组的c.p.m.值随加药浓度的升高逐渐下降，最高药物浓度(128μM)下c.p.m.值为2643±362.97。 (3)NCTD对肿瘤细胞DNA复制起始蛋白表达的影响方法：采用WesternBlot方法检测了NCTD(0-100μM)作用后DNA复制起始蛋白Cdc6和Cdc45蛋白表达的变化。 结果表明：NCTD作用后Cdc6蛋白被裂解成49KDa的片断，裂解效果呈现时间与剂量依赖性。随着NCTD剂量的增加对Cdc6的裂解作用越明显；且随着作用时间的延长，Cdc6包括49KDa的片断，被完全降解。通过分离提取细胞染色质组分蛋白发现，与染色质结合的Cdc6也被裂解。NCTD对Cdc45蛋白水平及染色质定位不产生影响。 (4)NCTD诱导的Cdc6裂解作用中泛素依赖的蛋白酶体或Caspase-3机制的参与？ 方法：我们分别应用了泛素依赖蛋白酶体的特异性抑制剂MG132和Caspase-3的特异性抑制剂Ac-DEVD-cho，观察其对NCTD诱导的Cdc6裂解的影响。 结果：泛素依赖的蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)不能抑制NCTD诱导的Cdc6的裂解，相反与NCTD单独作用相比，MG132与NCTD联合可导致更明显的Cdc6的裂解，而且MG132单独作用也可诱导Cdc6的裂解。在NCTD前2h加入Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-cho可以抑制NCTD诱导的Cdc6的裂解，Ac-DEVD-cho单独作用对Cdc6没有影响。 另外，采用Caspase-3酶活性检测试剂盒检测了NCTD作用后HL-60细胞Caspase-3活性的变化，结果发现NCTD作用Caspase-3酶活性明显增强。 (5)NCTD对HL-60细胞周期阻滞及凋亡的影响 方法：采用Hoechst33258染色、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪技术检测了NCTD作用后HL-60细胞凋亡特征的出现。WesternBlot检测了Bcl-2、Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白表达的影响。 Hoechst33258染色结果：对照组细胞核形态完整、染色均匀，50μMNCTD处理HL-60细胞12h后，细胞核出现浓缩、颗粒化并有凋亡小体出现。 DNA琼脂糖电泳结果：显示有DNA梯状条带出现。 流式细胞仪检测结果：50μM的NCTD可诱导HL-60细胞逐渐阻滞于G2/M期，至24h到达高峰，并且随着NCTD作用时间的延长，亚G1期细胞比例逐渐升高，至48h到达高峰(43.8％)。 WesternBlot结果：NCTD可下调Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白水平；Bcl-2蛋白表达不受影响。 (6)抑制Cdc6对肿瘤细胞生长的抑制作用方法：构建靶向于cdc6的RNAi质粒，脂质体介导转染HL-60细胞后，细胞周期分析及DNA琼脂糖电泳检测细胞的凋亡变化，MTT法检测细胞活力。 结果：构建的RNAi质粒pENTR-cdc6转染HL-60细胞后，可有效的沉默cdc6基因，使cdc6的mRNA和蛋白水平下调。沉默cdc6后，细胞周期结果显示细胞出现亚G1期阻滞(21.2％)，DNA琼脂糖电泳显示有DNA梯状带出现。沉默cdc6使HL-60细胞增殖受到抑制(P＜0.05)，与NCTD联合作用比NCTD单独作用抑制效果更强(P=0.024)。 结论 (1)NCTD可诱导肿瘤细胞Cdc6蛋白裂解，产生一约49KDa的小片断；与染色质结合的Cdc6也被裂解，从而阻碍pre-RC的形成，从起始阶段抑制DNA的复制。 (2)NCTD诱导的Cdc6的裂解依赖于Caspase-3的活性，同时NCTD可激活Caspase-3并诱导HL-60细胞凋亡。 (3)NCTD下调Cdk1、CyclinB1和Cdc25C蛋白水平，使HL-60细胞阻滞于G2/M期。 (4)RNAi方法沉默cdc6会诱导HL-60细胞凋亡，抑制细胞增殖，在一定程度上增强NCTD的增殖抑制作用。 (5)Cdc6蛋白参与了NCTD的抗肿瘤作用机制，是一个有前景的抗肿瘤靶点。