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骨质疏松症是多种原因引起的一种全身骨骼代谢性疾病,以骨量减少、骨组织微细结构受损为主要特征,导致脆性骨折的风险增加。骨组织形成的减少、骨质吸收增多是骨质疏松的主要病因。Wnt/β-catenin/Runx-2信号转导途径调节成骨细胞的分化、生长、凋亡等过程,是骨代谢过程中重要的信号系统。实验目的：本组前期从具有增强骨丢失小鼠骨密度的树豆脂溶性部位中分离到了具有促成骨细胞分化活性、增强小鼠骨密度的菧类单体成分树豆内酯A (CLA)。为了探讨CLA促进成骨的分子机制,本实验以人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs)为模型,探讨CLA对定向诱导的hMSCs成骨分化的影响,具体探讨其对成骨分化信号通路的影响,为CLA用于治疗骨质疏松症的药物开发提供实验依据。实验方法：(1)CLA对hMSCs增殖的作用：生长状态良好的第4-6代hBMSCs细胞和不同浓度CLA在生长培养基中共同培养48 h或72 h。CCK-8法检测细胞活力,评价CLA对细胞增殖的影响;(2)CLA对hBMSCs成骨分化作用：生长状态良好的hBMSCs第5代细胞在不同浓度CLA存在下,用成骨分化培养液对hBMSCs进行成骨分化诱导培养,在诱导的周期内分别对细胞进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色及茜素红S染色,观察其成骨活性和钙结节形成情况,判断CLA对hBMSCs成骨分化的作用；(3)CLA对hBMSCs成骨分化过程中Wnt/β-catenin/runx-2信号通路的影响：取第5代生长状态良好的hBMSCs,分别在不同浓度CLA存在下进行成骨分化诱导培养,以未添加CLA的诱导组为阳性对照组,以未进行成骨诱导的细胞为阴性对照组；分别在诱导培养第24 h,3 d、6 d、9 d和12 d提取总RNA,实时荧光定量RT-PCR法检测成骨前期转录因子Runx-2与Osterix,及Wnt/β-catenin经典信号通路的Wnt-3a, Wnt-5a, Wnt-10b,低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LRP-5/6), Frizzled (Fz)共受体,以及β-catenin基因的表达量。在诱导培养的第15 d提取总蛋白,蛋白印迹法(Western Blot)检测Runx-2、β-catenin, I型胶原蛋白(Collagen I),骨形态学蛋白(BMP-2),骨桥蛋白(OPN)的表达水平。实验结果：(1)CLA在10 μmol/L及以下浓度作用于hBMSCs 48,72h,不影响细胞的增殖,在20 μmol/L时对细胞表现出一定的抑制作用；(2)在诱导hBMSCs成骨分化过程中,碱性磷酸酶与茜素红S染色结果显示,CLA的三个剂量(4,2和1μmol/L)均有良好的促成骨分化作用,但是CLA 4μmol/L与2μmol/L两个剂量的作用效果没有明显的量效关系；(3)实时荧光定量RT-PCR结果显示：与未诱导分化组相比,诱导分化各组的细胞在分化周期第24h,3d、6d、9d和12d均检测到Wnt-3a, Wnt-10b, LRP-5,β-catenin, Runx-2与Osterix基因mRNA水平有明显上升；与诱导对照组相比,CLA三个剂量(2, 1,0.5μmol/L)对这些基因的表达在第24 h出现明显的促进作用,而在第3天或者6天各基因表达量均达到峰值,并出现明显的量效关系。第6天后,各基因表达量均出现表达量下降的趋势,并随着诱导时间的加长,趋于平稳的状态,药物作用无明显量效关系：(4)蛋白印迹法(Western Blot)结果显示：在诱导分化第15天,与未分化相比,诱导分化组的Runx-2,β-catenin, Collagen I, BMP-2, OPN的蛋白均有明显表达;与诱导剂组相比,CLA三个剂量组三个蛋白的表达水平明显升高。实验结论：树豆内酯A (CLA)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)有促进成骨分化的作用,可通过经典的Wnt/β-catenin信号通路及Runx-2, Osterix转录因子完成成骨分化。