猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的,该病1987年在美国首次发现,1991年在荷兰分离到病毒,我国于1996年分离到第一株病毒(CH-1a株)。目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。Nsp7蛋白是PRRSV的一个重要的非结构蛋白,免疫原性高,已经证实,在感染PRRSV的猪体内含有针对Nsp7蛋白的特异性抗体,且抗体在体内的持续时间很久,另外,Nsp7在不同毒株之间具有很高的保守性,是建立PRRSV鉴别诊断方法的理想靶蛋白。但目前对Nsp7蛋白的抗原表位知之甚少,本研究主要利用单克隆抗体和合成多肽来确定Nsp7蛋白的抗原表位,从而为研制新型诊断试剂奠定基础。主要研究内容包括:　　 1.PRRSV WUH1株Nsp7基因的克隆表达　　 提取PRRSV WUH1株的总RNA,利用特异性引物通过RT-PCR扩增获得Nsp7基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,获得原核表质粒pET-28a-Nsp7。在IPTG诱导下6His-Nsp7融合蛋白获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为37KDa,主要以可溶性形式存在。Western blotting检测证实表达产物具有良好的免疫学活性。　　 2.PRRSV WUH1株Nsp7蛋白单克隆抗体的制备　　 将原核表达的PRRSV Nsp7蛋白经Ni-NTA柱纯化后作为免疫原,免疫6周龄BALB/C雌性小鼠,经细胞融合,间接ELISA方法筛选,共获得19株抗Nsp7蛋白的单克隆抗体(D1F9、D3G10、D1E9、B2B3、B3D6、B1F7、B2E11、B1F5、D1C11、C4G7、C2A8、C2D11、B2G3、C3C7、B1F8、C4B2、B4H10、B4E2、D1C10)。采用秋水仙素裂解法对筛选到的杂交瘤细胞株进行染色体计数,染色体数在90～105条之间。亚类分析显示除B1F7为IgM亚类外其余均IgG1。　　 将19株杂交瘤细胞分别注射小鼠后,大量制备腹水。将构建的真核表达质粒PCAGGS-HA-Nsp7转染Hela细胞后,收集样品。经Western blotting和IFA验证表明除D1F9以外均能与真核表达的Nsp7蛋白发生特异性反应。　　 3.PRRSV Nsp7蛋白抗原表位的确定　　 结合相关生物学软件预测的Nsp7蛋白潜在的抗原表位的结果,将Nsp7蛋白截短成四个小的片段(pN71(1～116aa)、pN72(56～163aa)、pN73(112～213aa)和pN74(142～252aa)),分别构建这四个片段的原核表达质粒pET-28a-pN71、pET-28a-pN72、pET-28a-pN73和pET-28a-pN74。将构建好的质粒转化E coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,四个融合蛋白均获得高效表达。通过Western Blotting和间接ELISA验证,结果发现:19株抗Nsp7蛋白单抗中13株抗体可直接或间接的与pN72发生反应。　　 根据上述的结果,设计了一套包含整个pN72片段和其它潜在的抗原表位的16个短肽片段(SP1～SP16),每个多肽的长度约为15个aa,每相邻的短肽之间有5个aa的重复。通过间接ELISA的方法与19株抗Nsp7单抗进行反应,结果发现:D1E9,D1C10,D3G10与SP9和SP10有特异性反应,B1F5与SP10有特异性反应,其它的抗体与多肽之间均无反应。进一步将16个多肽分别与人工感染PRRSV在不同日龄采集的猪血清进行反应,发现只有SP10能被阳性血清识别,揭示了SP10也是PRRSV的一个特异性抗原表位。　　 本研究首次鉴定了PRRSV Nsp7蛋白上的一个特异性抗原表位(SP10),为建立新型的鉴别诊断方法和开发基因工程疫苗提供了有用的信息,同时也为研究PRRSVNsp7蛋白与宿主免疫系统之间的相互作用奠定了一定的基础。