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替格瑞洛是一种具有较好市场前景的抗血小板药物,与同类药物(例如氯吡格雷)相比,替格瑞洛能更快、更强地抑制血小板。(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和(1R,2R)-2-(3,4-二氟苯基)-1-环丙烷羧酸乙酯均为手性抗凝血药物替格瑞洛的关键中间体,本文分别对这两种化合物的酶促合成进行了研究。通过基因挖掘法在Thermomyces dupontii中发现一种新型的脂肪酶(TDL),对其进行了克隆表达,蛋白纯化,结果显示,该蛋白分子量30 kDa,与预测值相符。对该蛋白进行活性验证,结果显示,在1 ml pH=7磷酸缓冲液体系中 30℃ 反应 24 h,3 g/L Thermomyces dupontii Lipase(TDL)催化1g/L底物2-(3,4-二氟苯基)-1-环丙烷羧酸乙酯有活性,表现出预计的S选择性,eep≥99%。通过基因挖掘法得到了来自Rhodococcus kyotonensis的羰基还原酶(Rhky-ADH)的基因序列,克隆表达后,将质粒转化到大肠杆菌载体中,得到包含羰基还原酶基因序列的工程菌,对该蛋白进行诱导表达,得到了基因工程菌全细胞,用全细胞对底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮进行催化还原反应,结果显示,100 mg湿菌体作用于6 mg底物,添加0.5 g/L辅酶NADH,在1 ml pH=7的磷酸缓冲液体系中反应,Rhky-ADH能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮产生目标产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)-1-乙醇,转化率≥99%,eep≥99%。对Rhky-ADH全细胞催化条件进行优化。结果表明,Rhky-ADH是辅酶NADH依赖型蛋白,辅酶浓度为0.5 g/L;底物浓度80 g/L,菌体的湿重量100 g/L,15%(v/v)异丙醇作为助溶剂,pH=8.0,T=30℃,表现出最优反应活性,转化率>90%。对pH耐受性,温度耐受性进行研究,结果表明:在pH=7～9均具有较好的活性,酶在25℃孵育8 h后,残留活性大于80%,该酶稳定性较好,在常温下不容易失活;金属离子对酶活影响较小,Mn2+能提高8%左右的相对活性。对Rhky-ADH底物适应性以及活性位点进行了研究。研究结果表明,Rhky-ADH对苯乙酮以及其衍生物均有非常好的活性,并且具有非常良好的立体选择性。在对Rhky-ADH活性位点进行研究的时候发现,Rhky-ADH具有四个氨基酸残基Tyr,Lys,Ser和Asn,将其中任意一个残基突变为丙氨酸,突变蛋白便失去了活性,这符合短链脱氢酶家族的特点。