蜡梅(Chimonanthus praecox L.)属于木兰纲(Magnoliopsidae)樟目(Laurales)蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)植物,在我国栽培历史有千年之久,是我国著名木本花卉。蜡梅花开冬季,花香十里,特殊的花期与浓郁的花香使其成为冬季赏花的理想花木,被广泛应用于园林建设、盆景、切花栽培以及香料的提取,具有极大地观赏和经济价值。作为木兰类植物的代表,蜡梅同样具有重要系统进化位置,目前关于木兰类植物与单双子叶的系统进化关系还存在较大争议。近年来,关于蜡梅的研究主要集中于花香、花色及开花时间等优质性状,然而由于蜡梅完整基因组信息的匮乏,严重阻碍了其优质性状分子研究的开展。因此,本研究对蜡梅开展全基因组测序,并对蜡梅基因组特征进行全面系统解读,结合蜡梅花香代谢和转录组数据系统分析花香合成、调控相关基因,深入分析与花香主成分(芳樟醇和乙酸苄酯)合成相关基因家族,同时挖掘关键基因并进行功能鉴定。主要研究结果如下:1.获得了高质量染色体级别基因图谱并完成了基因组注释。通过survey分析发现蜡梅基因组的大小约为778.71Mb,杂合度为0.60%,重复序列占比56.20%。本研究采用第二代Illumina和第三代Pac Bio测序技术对蜡梅进行全基因组测序和初步组装,并通过10X Genomics测序进行基因组的辅助组装,最后利用Hi C技术将蜡梅染色体进一步锚定到了11条染色体。测序获得269.7Gb的数据量,测序深度为346.35X,组装得到基因组大小为695.36 Mb,其中contig N50,scaffold N50,super scaffold N50分别为2.19 Mb、4.49Mb,66.35 Mb。BUSCO和CEGMA评估结果显示在蜡梅基因组中分别有95.02%和92.74%真核生物核心基因得到鉴定。以上结果表明基因组完整度高和连续性好,组装得到了高质量蜡梅基因组。采用同源预测、De novo预测以及基于转录组数据预测的方法,注释得到了23,599个结构基因,其中2,1940个基因被注释为蛋白编码基因。另外还注释得到了307.67Mb的重复序列以及2,749个非编码RNA。2.明确了蜡梅系统进化位置并鉴定到了两次全基因组复制事件。通过对包括蜡梅以及夏蜡梅在内总共17个物种的比较基因组分析,确定了木兰类植物与双子叶植物互为姐妹群的系统进化关系。木兰类植物与双子叶植物分歧时间大约在140.0(113.0～153.1)百万年前,大约在10.0(4.9-24.9)百万年前蜡梅与夏蜡梅发生物种分歧。通过对蜡梅基因组内以及与其它物种间的共线性分析和共线性区块内同源基因的4Dtv和Ks分析,确定蜡梅基因组在进化过程中经历了两次全基因组复制事件,其中远期全基因组复制事件大约发生于112.1百万年前,在樟科和蜡梅科分化之前,蜡梅科与木兰科分化之后;近期事件大约发生于77.8百万年前,在蜡梅和夏蜡梅分化之前,樟科与蜡梅科分化之后。染色体进化过程中经历了49次融合和48次断裂最终形成了当今的11对22条染色体。3.通过转录组与花香代谢数据联合分析鉴定到了蜡梅花香合成相关功能基因和转录因子。对蜡梅花芽期、盛开期以及末花期样本进行转录组测序组装得到了25,829个基因。通过三个时期转录组比较分析发现7,210个基因在三个时期间均差异表达。对三个时期四种花香主成分(芳樟醇、乙酸苄酯、水杨酸甲酯以及罗勒烯)的释放规律进行检测,结果表明4种成分的释放均受到花发育的调控,表现为先增高后降低的变化趋势。从基因组层面对萜烯类和苯丙素/苯环类化合物合成相关通路上的基因进行鉴定,分别得到88和111个候选基因,其中两类物质合成相关通路分别有48和63个基因在花发育过程中表达。将三个时期花香成分变化规律与这些基因表达进行关联分析,进一步挖掘出蜡梅花香合成通路上关键节点基因Cp AACTs、Cp DXSs、Cp DXRs、Cp PALs以及末端Cp TPSs、Cp SAMTs和Cp BAHDs基因。共线性分析表明多数花香合成关键节点基因是通过串联复制和全基因组复制事件产生的。通过三个时期基因表达趋势与花香释放规律关联分析还鉴定到了99个调控蜡梅花香合成的潜在转录因子。4.揭示了蜡梅特征性香气成分芳樟醇合成进化机制,同时鉴定到了芳樟醇合成酶基因Cp TPS4的等位基因Cp TPS4-AS2,该基因编码的蛋白具有催化产生橙花叔醇的功能。蜡梅基因组层面总共鉴定到52个萜烯合成酶基因。系统进化分析表明52个基因分布于5个被子植物特有分支,其中24个属于TPS-b分支。比较基因组分析发现蜡梅TPS-b亚家族发生了扩张,而串联复制是导致TPS-b亚家族扩张的主要原因。转录组分析表21个Cp TPSs基因在花中花发育不同时期表达,其中TPS-b亚家族中的4个基因(Cp TPS4和其3个拷贝基因Cp TPS17、Cp TPS18和Cp TPS19)在花中显著高表达,并且表达变化趋势与芳樟醇释放规律相一致。进一步分析发现Cp TPS17、Cp TPS18和Cp TPS19三个基因是由串联复制事件产生,前期已证明Cp TPS4具有芳樟醇合酶的功能,因而我们推测串联复制带来芳樟醇合成酶基因拷贝数的增加,不同拷贝基因选择性在花中高表达进而带来蛋白剂量上的变化,从而导致蜡梅特征香气芳樟醇产生的原因。利用基因组和转录组鉴定到了芳樟醇合成酶(Cp TPS4)的等位基因Cp TPS4-AS2。氨基酸比对分析发现,与Cp TPS4不同,Cp TPS4-AS2缺少N端的质体定位信号肽。亚细胞实验进一步证实C p T P S 4和Cp TPS4-AS2具有不同的亚细胞定位,分别定位于质体和细胞质。蛋白酶活实验表明这两个等位基因在体外具有相似的催化功能,都能以GPP为底物催化产生芳樟醇,以FPP为底物产生橙花叔醇。因而推测Cp TPS4-AS2为倍半萜橙花叔醇合成酶。实时定量PCR分析发现Cp TPS4和Cp TPS4-AS2在花发育过程中具有相似的表达模式,比较发现这两个等位基因的启动子元件有很大的差异。5.鉴定到了控制蜡梅花香主成分乙酸苄酯合成的关键基因。从基因组中鉴定到33个BAHD基因家族成员,分别聚类到4个不同分支,其中21个Cp BAHDs基因分布在与挥发性酯类合成相关的第III和第V分支。共线性分析发现6条基因源于全基因组复制事件,18条基因由串联复制事件产生。结合基因组、转录组和代谢组筛选得到4条乙酸苄酯合成候选基因Cp BAHD1、Cp BAHD3、Cp BAHD4和Cp BAHD32。通过克隆和序列比对分析发现4条基因都具有酰基转移酶保守功能域HXXXD和DFGWG。体外酶活实验证实Cp BAHD1、Cp BAHD3和Cp BAHD32具有催化合成乙酸苄酯的功能,本氏烟草瞬时转化实验表明分别瞬转Cp BAHD1、Cp BAHD3和Cp BAHD32基因的烟草叶片在外施苯甲醇底物时都能合成挥发性乙酸苄酯,进一步证明这三个基因具有乙酸苄酯合成酶的功能。对三个基因在不同组织部位表达分析表明只有Cp BAHD1基因在花中特异性高表达,因而该基因可能为控制蜡梅花香乙酸苄酯合成的关键基因。综上所述,本研究完成了蜡梅全基因组测序,获得了高质量染色体水平的基因组;鉴定到了两次全基因组复制事件,同时明确了蜡梅(木兰类植物)的系统进化位置;揭示了蜡梅特征性香气成分芳樟醇合成进化机制并鉴定到了蜡梅花香第二大组分乙酸苄酯合成的关键基因。以上结果为蜡梅花香性状改良提供理论依据,同时为将来进一步深入开展分子遗传学研究,鉴定控制蜡梅开花时间、花香花色等众多性状的功能基因提供遗传信息资源。