研究目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)神经功能障碍和变性、凋亡的起始因素及一系列分子细胞事件发生的具体机制目前仍未完全阐明,β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)沉积、氧化应激、高度磷酸化tau蛋白、Ca2+调节紊乱、能量代谢障碍以及被认为与AD发生有关。β-淀粉样蛋白在脑内的异常沉积是其特征性的病理学变化,其中Aβ1-42是最先沉淀且最难溶解,是细胞毒性作用较强的淀粉样物质。Aβ细胞毒性作用的机制复杂,已有的研究证实Aβ能过度激活N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体,导致胞内钙超载,引起神经变性和突触功能障碍。NMDA受体是脑内重要的离子型谷氨酸受体,在突触间信号传递传递、长时程增强(long-term potentiation, LTP)等过程中发挥重要作用。NR2B是NMDA受体的调节亚单位,对NMDA受体的结构和功能有十分重要的作用。NR2B亚基可调节NMDA受体介导的兴奋性突触后电位,影响中枢神经系统的突触可塑性；同时含NR2B的MDA受体离子通道对Ca2+表现出较高的通透性,是一个治疗与NMDA受体相关疾病的潜在靶点。ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP)是存在细胞膜与线粒体内膜的异源多聚体通道,通过感受细胞内ATP/ADP水平的变化,将细胞代谢状态与电活动偶联在一起。近年来研究表明ATP敏感性钾离子通道的激活在中枢神经系统发病机制中发挥重要的神经保护作用。已有研究发现线粒体KATP通道开放药物二氮嗪(Diazoxide, DIZ)可明显降低Ap寡聚体聚集和Tau蛋白过度磷酸化,且能改善转基因AD鼠模型的认知功能障碍；我们前期实验已证实：二氮嗪预处理可改善Aβ1-42建立鼠模型的学习和记忆功能,并提高Bcl-2表达量,降低Caspase3的表达量,提示二氮嗪具有抗细胞凋亡作用,同时可逆转Aβ1-42作用胆碱能神经元导致的KATP通道亚基过表达,抵抗Aβ1-42的神经毒性,进一步研究发现信号通路NF-κB、p38MAPK、PKC均在其中发挥了重要作用。本研究旨在探讨KATP通道开放剂二氮嗪对Ap作用于原代培养神经元NR2B亚基蛋白表达的影响,为探索AD新的靶向药物提供基本理论依据。研究方法：本实验采用细胞原代培养的方法,培养新生Wistar大乳鼠皮层和海马神经元。原代培养的神经元进行爬片至第7d时,采用免疫荧光细胞化学的方法对皮层海马神经元NMDA受体NI2B亚基蛋白的表达进行检测。将培养至第7d的细胞随机分为2个小组,每小组分4亚组。一个小组分组为：空白对照组、单纯Aβ1-42(2μmol/L)干预组、Aβ1-42+二氮嗪干预组(Aβ2+DIZ干预组)、单纯二氮嗪(50μmol/L)干预组。每组药物干预方法：对照组加入等量的D-Hanks和培养液；单纯Aβ1-42(2μmol/L)干预组：给予2μmol/L的Aβ1-42培养；Aβ1-42+DIZ干预组：先用Diazoxide(DIZ)预处理培养神经元1h,再加入2μmol/L的Aβ1-42培养；单纯二氮嗪(50μmol/L)干预组：加入Diazoxide(DIZ)预处理培养神经元1h后,加入等量的D-Hanks和培养液继续培养。将四个亚组药物处理后分别培养24h和72h,采用Western blot的方法分别检测Aβ1-42和Diazoxide作用不同时间后细胞NR2B亚基蛋白表达水平的变化。另一小组的4个亚组分别用不同浓度(0、2μM、5μM、10μM的Aβ1-42作用原代培养神经元,分别作用72h后,采用Western blot的方法分别检测Aβ1-42和Diazoxide作用不同时间后细胞NR2B亚基蛋白表达水平的变化。研究结果：(1).皮层及海马神经元免疫荧光染色结果显示：蓝色为DAPI染的细胞核,红色为NR2B亚基蛋白,可以看出NR2B亚基在皮层及海马神经元胞膜的荧光强度值较高,树突及轴突的荧光强度值也高但不如胞膜明显,说明均有NR2B亚基在皮层及海马神经元胞膜、树突及轴突均有表达；(2).单纯Aβi-42(2μmol/L)作用胆碱能神经元24h后,NR2B亚基蛋白表达水平与对照组相比没有明显变化(p>0.05)；二氮嗪(5μmol/L)预处理细胞1h后Aβ1-42(2μmol/L)共同作用24h,NR2B亚基蛋白表达较单纯Aβ1-42干预组没有明显改变(p>0.05)。(3).通过应用不同浓度(0、2μM、5μM、10μM)的Aβ1-42作用原代培养神经元72h后,可见随着Aβ1-42作用浓度的不断增高,NR2B亚基蛋白表达量呈浓度依赖性逐渐升高,并有统计学差异(p<0.05)。(4).单纯Ap1-42(2μmol/L)作用胆碱能神经元72h后,NR2B亚基蛋白表达较对照组显著升高(p<0.05)；经二氮嗪(50μmol/L)预处理细胞1h后,再与Aβ1-42(2μmol/L)共同作用72h,蛋白电泳显示NR2B亚基蛋白表达较单纯Aβ1-42干预组明显降低p<0.05)；单纯二氮嗪干预组NR2B亚基蛋白表达较对照组无明显差异(p>0.05)。研究结论：(1).原代培养的大脑皮层和海马神经细胞中,NR2B亚基在神经元胞膜、树突及轴突均有表达,且细胞膜表达量最高；(2).Aβ1-42作用原代培养神经元72h,能够显著增加神经细胞NR2B亚基蛋白的表达量,同时ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪能拮抗Aβ1-42所引起的NR2B亚基蛋白表达量的升高,提示二氮嗪可能通过NMDA受体通路影响Aβ1-42的细胞毒性作用。