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背景与目的： 肿瘤的发生、发展不仅取决于肿瘤细胞本身，而且还取决于肿瘤细胞赖以生存的微环境。文献报道以及我们课题组前期研究证明，肿瘤缺血、缺铁、缺氧等应激微环境诱导肿瘤过表达以及释放的应激分子，如热休克蛋白家族（HSPs）作为内源性模式分子在肿瘤的发生、发展中起重要作用。然而作为细胞铁摄取的转铁蛋白受体（TfR）的表达与对铁的利用以及与HSPs之间的相互关系尚不清楚。基于此，本课题设计分别构建人HSPA1，抗人TfR-scFv-Fc2融合蛋白，以及抗TfR-scFv-D4S×5融合蛋白真核表达载体，旨在获得表达HSPA1以及抗人TfR单链抗体（scFv）融合蛋白，为探讨转铁蛋白受体对铁的摄取与利用对HSPs表达与释放的影响，以及在肿瘤中的作用研究奠定基础。 方法： 1.人HSPA1原核表达载体的构建、表达与鉴定 查找HSPA1的基因序列并设计相应引物。从人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA，采用RT-PCR的方法扩增HSPA1的基因片段，并在两端加入酶切位点。酶切之后与原核表达载体pGEX-4T-3连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆并提取质粒，酶切鉴定并测序。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21进行表达。通过摸索表达产物对IPTG浓度与时间的依赖性以来确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间。表达产物采用GST Spin purification kit进行纯化。并采用SDS-PAGE，western blot对表达产物进行鉴定。 2.抗人TfR-scFv与抗TfR-scFv-D4S×5融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定 （1）不同分子模式的抗人TfR-scFv融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定 1）抗人TfR VH-linker-VL真核表达载体的构建：以pTfR-scFv-EGFP为模板，设计两对引物引入酶切位点EcoRⅠ和NcoⅠ，用PCR的方法扩增分别含有VH和VL的两个片段。利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）的方法扩增含有全长基因的VH-Linker-VL片段。并将该片段克隆至pFUSE-hIgG1-Fc2载体。获得重组质粒pFUSE-VH-linker-VL-Fc2，转化DH5α，挑选单克隆，扩增后提取质粒酶切，并测序鉴定，将含目的基因正确序列的表达载体命名为pFUSE-VH-VL。 2）抗人TfR VL-linker-VH真核表达载体的构建：设计并合成VL-Linker- VH基因片段，将VL-Linker-VH基因片段按照上述方法克隆至pFUSE-hIgG1-Fc2载体，获得重组质粒pFUSE-VL-linker-VH-Fc2。然后酶切，测序鉴定，将含目的基因正确序列的表达载体命名为pFUSE-VL-VH。 （2）不同分子模式的TfR-scFv-D4S×5融合蛋白真核表达载体的构建 设计并合成寡肽尾（D4S×5）-HIS×6基因，分别克隆至上述pFUSE-VH-VL和pFUSE-VL-VH载体，获得重组质粒pFUSE-scFv-D4S×5-HIS×6（VH在前）和pFUSE-scFv-D4S×5-HIS×6（VL在前），进一步对两种载体进行酶切，测序鉴定。 （3）抗人TfR-scFv及其寡肽尾融合蛋白的表达 将上述鉴定正确的四种质粒和空载质粒用质粒大提试剂盒大抽质粒，线性化后转染CHO细胞并构建稳转细胞系。大规模培养并收集上清纯化后用SDS-PAGE，Western-blot，FCM对其结构与活性进行鉴定。 结果： 1.人HSPA1的表达与鉴定结果 RT-PCR扩增获得大小约为2kb的基因片段，与原核表达载体pGEX-4T-3连接后转化DH5α，挑取阳性克隆，经测序为目的基因片段。将测序正确的质粒转化BL21，探索出IPTG的最佳诱导时间与浓度为分别为7h，0.5mM。表达产物经GST Spin purification kit纯化后采用SDS-PAGE分析，在72Kd出有单一条带，与目的蛋白分子量相符。western blot鉴定，该蛋白能与抗HSPA1的抗体特异性结合。 2.抗人TfR-scFv与抗TfR-scFv-D4S×5融合蛋白真核表达载体的构建 测序结果表明，构建的四种表达载体基因序列正确，读码框无误与酶切鉴定结果一致。并成功建立了四种表达载体的稳转细胞系。 结论： 采用分子生物学与免疫学技术分别构建了人HSPA1及抗TfR-scFv融合蛋白的原核与真核表达载体，并进行了表达与鉴定，实验结果表明：①成功构建了HSPA1的原核表达载体，并能够在宿主菌BL21中表达，表达产物能与抗HSPA1的抗体特异性结合；②成功构建了pFUSE-VH-linker-VL-Fc2，pFUSE-VL-linker-VH-Fc2，pFUSE-scFv-D4S×5-HIS×6（VH在前）和pFUSE-scFv-D4S×5-HIS×6（VL在前）四种真核表达载体，其表达条件尚待探索。本实验所获结果为进一步表达获得HSPA1和抗TfRscFv融合蛋白，以及探索转铁蛋白受体的表达调控与HSPs表达与释放之间的关系，及其在肿瘤中的作用研究奠定了基础。