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目的:通过网络药理学和实验验证结合,评价虎贞痛风方(HZTF)对急性痛风性关节炎(AGA)疗效,探究其潜在作用机制,为HZTF的临床应用提供理论基础。方法:1.网络药理学评价采用网络药理学方法对HZTF治疗AGA的潜在作用机制进行分析,具体步骤如下:首先,通过TCMSP数据库检索并筛选HZTF处方各单味中药的有效成分及其靶点构建成分靶点数据库;然后,从TTD、Drug Bank等数据库筛选AGA相关的靶点构建疾病靶点数据库;进一步将两个数据库的靶点进行映射得到共同靶点,使用Cytoscape软件构建HZTF治疗AGA的靶点网络,进一步利用DAVID 6.8对关键靶点进行富集分析,得到HZTF治疗AGA的潜在机制。2.体内外验证实验(1)AGA模型的建立采用C57BL/6小鼠构建治疗给药型痛风模型,以微晶尿酸钠(MSU)作为诱导剂,分别从诱导剂量和诱导时间进行探讨,通过对比关节肿胀度和炎症因子水平,寻找最合适的剂量和时间,建立稳定的模型。(2)HZTF干预AGA效果验证利用HZTF治疗MSU诱导的小鼠AGA模型,观察其关节肿胀度,步态的变化,检测关节组织促炎物质的mRNA表达、关节冲洗液中的一氧化氮(NO)及炎症因子的含量,评价HZTF对AGA的疗效。(3)细胞水平验证实验基于网络药理学的机制预测,从体外水平进行实验验证。结合分子生物学技术,如MTT、qPCR、ELISA、Western Blot等,深入探究HZTF的潜在机制。结果:1.网络药理学评价以口服利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18为条件,筛选到与HZTF有关的34种有效成分,对应181个靶点,此外,TTD等5个常见的数据库提供了224个与AGA相关靶标。通过Cytoscape软件构建了成分-靶点网络和蛋白-蛋白相互作用网络,经网络分析功能获取拓扑参数,按照“度”≥12,“接近中心性”≥0.309,“介数中心性”≥0.002进行筛选,得到了77个重要靶点。GO富集结果表明,多个靶点涉及positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、inflammatory response、extracellular space、heme binding等生物过程。KEGG通路富集提示花生四烯酸通路的关联性远远强于其他通路。2.体内外实验验证(1)AGA模型的建立不同诱导时间(12、24、48、72 h)和不同MSU诱导剂量(4、8、20 mg/mL)引起的AGA严重程度各不相同,诱导超过24 h出现炎症消退现象,当诱导剂量大于8 mg/mL时未观察到明显的量效关系,综上,8 mg/mL的MSU诱导12 h形成的模型可用于后续的药效评价。(2)HZTF干预AGA效果验证经HZTF给药处理,改善了MSU引起的AGA,如关节肿胀度降低,步态改善,关节组织炎性物质表达下调,关节冲洗液中的NO及炎症因子的含量降低。(3)细胞水平验证实验HZTF未发现对RAW264.7细胞产生明显毒性。HZTF对IL-1β,IL-6,TNF-α,COX-2等炎性物质的转录和产生具有显著抑制作用,同时,下调了胞内的活性氧(ROS)水平。Western Blot检测发现HZTF组显著抑制了与花生四烯酸通路相关的COX-1,COX-2和5-LO蛋白的表达。结论:1.通过网络药理学,提示了花生四烯酸代谢途径是HZTF治疗AGA涉及的关联性最强的信号通路。2.药效学结果表明HZTF能显著缓解MSU诱导的小鼠AGA,对关节肿胀度、步态、关节部位炎症反应均有明显改善作用。3.通过体内外实验证实HZTF通过抑制花生四烯酸途径及炎症性细胞因子和介质(如IL-1β,IL-6,TNF-α)缓解了AGA中的炎症反应。