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用Hep-2细胞从广州市儿童医院临床病人呼吸道分离腺病毒,经PCR分型鉴定为广州地区流行株3型腺病毒。在P3实验室用Hep-2细胞对分离的3型腺病毒进行了增殖培养,待细胞发生95%左右典型病变时收获病毒。
通过反复快冻快融3次,使细胞破碎,充分释放病毒颗粒。高速离心去除大部分的细胞碎片,用Milipore公司生产的切向流膜堆(100K和300K)对腺病毒进行分子截留。利用表而活性剂对3型腺病毒进行裂解,再用DEAE-Sephadex A-50弱阴离子交换柱对六邻体(Hexon)蛋白进行纯化,电泳鉴定该蛋白大小为120KD左右,Western blotting鉴定为六邻体蛋白。
将纯化的六邻体蛋白在酶标板条内进行包被,优化各科条件,建立了腺病毒IgM抗体诊断试剂。本研究的诊断试剂与德国欧蒙医学实验诊断有限公司的腺病毒IgM抗体诊断试剂分别对810份的临床标本进行检测,总符合率为98.64%。
用中山医科大学实验动物中心提供的SPF级Balb/c小鼠和新西兰大白兔进行常规免疫程序制备抗体,分别获得效价在1:10万左右的多抗血清,获得4株质量较好的单克隆细胞株分别编号为ADV-1,ADV-2,ADV-3,ADV-4。
经过抗体配对模式比较,确定包被抗体ADV-3以及标记抗体ADV-4,并对两种抗体活性效价、纯度、IgG亚型、特异性进行鉴定,研制开发了一种腺病毒抗原诊断试剂;本研究的诊断试剂与德国欧蒙医学实验诊断有限公司的腺病毒抗原诊断试剂或华银基因科技有限公司生产的荧光PCR诊断试剂,分别对1023份临床标本进行检测,总符合率为99.02%。
本论文主要对呼吸道3型腺病毒的生物学特性和临床检测技术及应用进行了初步研究,填补了3型呼吸道腺病毒该方面的研究空白,满足了国内临床呼吸道腺病毒检测的需求,有效提高了呼吸道腺病毒传染病的防治能力,具有广阔的临床应用前景。