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本文利用携带狂犬病毒HEP—Flury株全长基因组的质粒pHEP一3．O和4个辅助质粒pH—N，pH—P’pH—L，pH：G，进行了．HEP一。Flury株病毒的拯救工作。
结果表明，5个质粒按1．251xg pHEP一3．O，0．3 1251xg pH—N，O．15625~g pH—P，0．0625~g pH—L，0．09375~g pH．G的量共转染BHK一21细胞，37℃培养2天，34℃培养4天以拯救狂犬病毒。取反复冻融的细胞液接种于96孔细胞培养板，37℃培养2天，34℃培养4天后，丙酮固定，抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体标记，荧光显微镜下观察，发现大量荧光点；证实获得了病毒rHEP—Flury株。该病毒传代5代次，经RT_PCR鉴定，表明该病毒稳定存在。本研究以自行设计的引物，扩增重组质粒pMD—HA5中的HA基因(该基因为禽流感病毒H5N1亚型AⅣA／Chicken／Guangdong／25／2000株中的HA基因)。通过核酸限制性内切酶处理pHEP．3．0和HA基因，将HA基因插入狂犬病毒jHEP一。Flury株全基因组的伪基因(、l，)区域，构建得质粒pHEP．3．0HA。该质粒与表达HEP—Rury株辅助蛋白的pH．N，pH—PpH．L，pH—G质粒共转染BHK一21细胞，培养5天后，取冻融细胞液接种于96孔细胞培养板培养，抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体检测，证实获得了嵌合病毒HFHA。该病毒经BHK一21细胞传代5代，RT-PCR鉴定，病毒稳定存在，但各代次常规病毒红细胞凝集试验均为阴性；Western—blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达。取其：HFHA 5代病毒，RT-．PCR扩增HA基因全长，连接pMDl9．T Simple载体。测序结果显示，HA基因ORF框编码起始密码子的碱基ATG中A缺失。应用长链PCR方法，以自行设计的引物，将携带HEP—Flury株全长基因组的表达质粒pHEP一3．0中编码狂犬病毒磷蛋白(P)和基质蛋白(M)的P、M基因缺失，构建得载体质粒p3．1。再通过PCR方法，扩增P、M基因，连接pMDl9一T Simple载体，构建得pMDl9TPM质粒。利用核酸限制性内切酶处理pMDl9TPM和p3．1质粒，将P、M基因插入p3．1中，构建得狂犬病毒G基因在全长基因组中为第二位的表达质粒p3．2。该质粒与pH—N，pH一只pH—L，pH—G共转染BHK一21细胞，培养，筛选，通过抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体检测，证实并获得了重组病毒：HEP．-Flury(N1G2)。但在BHK一2l细胞上传代培养，盲传5代，荧光抗体检测，显示该病毒繁殖量低；同时经过重复性病毒拯救试验、拯救病毒传代试验，其拯救病毒的繁殖率未见提高。
综上所述，利用携带狂犬病毒 HEP-Flury 株全长基因的表达质粒pHEP-3.0和4个辅助质粒pH-N，pH-P，pH-L，pH-G在BHK-21细胞中能够有效的拯救出重组的狂犬病毒；其狂犬病毒嵌合病毒的拯救研究，表明 HEP-Flury株全基因组中的伪基因区域，可以利用人工构建的转录起始和终止序列，稳定表达外源基因；经过基因重排后的病毒，可以获得拯救，但病毒的繁殖率低。这些研究为深入研究狂犬病毒基因与功能的关系奠定了基础。