慢性盆腔痛是子宫内膜异位症(.endometriosis,EMs)常见的临床表现之一,严重影响患者的日常生活和工作。目前,药物激素治疗和腹腔镜手术治疗是EMs慢性盆腔痛的常用治疗手段,但仍存在较高的复发率。因此,延长EMs无症期和预防再次复发成为EMs慢性盆腔痛的治疗靶点。如何选择合适的治疗策略用于治疗EMs慢性盆腔痛和防治其再次复发成为亟待解决的研究热点。EMs发病机制虽然仍不明确,但近年研究表明EMs慢性盆腔痛和“免疫-炎性效应”密切相关,即包括免疫细胞因子、炎性通道和炎性趋化因子等。基于此关系我们提出“EMs盆腔血瘀微环境”这一全新理论,认为其是连接“血瘀”和“免疫炎性效应”的桥梁,故创立“活血化瘀药物能够改善EMs盆腔血瘀微环境而抑制免疫炎性效应”的假说。“丹枝饮”是治疗EMs慢性盆腔痛的经验用方,有较好疗效。前期实验研究表明丹枝饮能够降低子宫内膜腺上皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,说明丹枝饮可调控“免疫-炎性效应”,但其具体的作用机制并未研究。围绕上述问题,本研究进行了三方面的探讨,即:①临床研究:丹枝饮治疗气滞血瘀型EMs慢性盆腔痛的临床疗效观察;②动物实验:丹枝饮对EMs大鼠c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)信号传导通路及相关炎性因子的影响;③细胞实验:基于小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)探讨丹枝饮通过“IL-17A/F—JNK—MCP-1/MIP-2”信号传导通路改善EMs盆腔血瘀微环境的机制。1.临床研究:①目的:观察丹枝饮对气滞血瘀型EMs慢性盆腔痛患者盆腔痛视觉模拟评分(visualanaloguescale,VAS)、中医证候积分以及子宫内膜异位症专用生存质量评分(the endometriosis heath profile-3 0,EHP-3 0)的影响。②方法:采用前瞻性随机对照试验,以“丹莪妇康煎膏”为对照药物,共纳入气滞血瘀型EMs慢性盆腔痛患者70人(2016年5月-2017年10月),随机分为试验组和对照组:试验组:口服丹枝饮颗粒制剂(一次一袋,日2次),对照组:冲服丹莪妇康煎膏(一次10-15g,日2次),两组患者均用药3个月经周期。主要疗效指标为治疗期间EMs慢性盆腔痛VAS评分(自身前后比较和组间比较),次要疗效指标包括中医证候积分和EHP-30生活质量评分。安全性包括:治疗前后不良反应、肝肾功能、血尿常规等。③结果:与治疗前比较,试验组治疗1周期后、2周期后、3周期后慢性盆腔痛VAS评分均有明显下降(P<0.01),与对照组比较,下降趋势明显(P<0.05),说明丹枝饮能明显缓解EMs慢性盆腔痛。与治疗前比较,试验组在服用丹枝饮治疗1周期后、2周期后、3周期后,中医证候总积分均有明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);试验组治疗后中医证候总积分与对照组比较,下降趋势无差异(P>0.05)。说明丹枝饮可以有效的改善中医证候,但效果和丹莪妇康煎膏无差异。将中医证候各条目细分后与对照组比较,非经期腹痛、经行不畅、经色紫黯、以及乳房胀痛共4项条目的下降趋势明显,差异有统计学意义(P<0.05);其余5项即经行腹痛(P=0.019)、肛门坠痛(P=0.924)、性交痛(P=0.825)、胸闷不舒(P=0.436)、烦躁(P=0.752)的下降趋势无差异。EHP-30核心问卷部分,与治疗前比较,试验组治疗后的5个维度评分均有明显下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,试验组在疼痛控制和情绪两个维度的下降趋势有差异(P<0.05)。说明丹枝饮可以普遍提高EMs内异症患者的生活质量。其中,针对疼痛和情绪两个方面的影响更为突出。EHP-30组合问卷部分,与治疗前比较,试验组治疗后6个维度评分均有明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,试验组在6个维度评分的下降趋势无差异(P>0.05)。④结论:丹枝饮能明显降低EMs慢性盆腔痛患者的VAS评分,起到治疗效果;同时改善患者的生活质量状况,并在疼痛控制和情绪管理方面更为突出。2.动物实验:①目的:观察丹枝饮对建立EMs模型大鼠的JNK炎性通路、相关炎性因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)、以及免疫细胞因子白介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)和白介素-17F(interleukin-17F,IL-17F)的影响。②方法:30只8周龄SD大鼠(雌性)分为手术组(n=24只)和空白对照组(n=6只),采用子宫内膜自体移植的方法建立子宫内膜异位症的大鼠模型。造模4周后对手术组EMs大鼠随机分为4组:模型组、丹枝低、中、高剂量组。每组6只,连续灌胃3周。灌胃结束后麻醉大鼠进行剖腹以获取子宫内膜异位组织用于免疫组化法检测JNK磷酸化表达水平,收集大鼠腹主动脉血用于酶联免疫吸附测定(enzyme linked immune-sorbent assay,ELISA)检测MCP-1、MIP-2、IL-17A、IL-17F的表达水平。③结果:与空白对照组比较,模型组大鼠血清中IL-17A、IL-17F、MCP-1和MIP-2含量均升高(P<0.05);与模型组比较,丹枝饮高、中、低剂量组SD大鼠血清中IL-17A、IL-17F、MCP-1和MIP-2含量明显降低(P<0.05)。与空白对照组比较,模型组SD大鼠异位内膜组织中p-JNK含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,丹枝饮高、中、剂量组异位内膜组织中磷酸化氨基末端蛋白激酶(phpspho-c-JunN-terminalkinase,p-JNK)含量均明显降低(P<0.01)。④结论:EMs大鼠体内免疫细胞因子(IL-17A和IL-17F)和炎性趋化因子(MCP-1和MIP-2)呈高表达状态,而丹枝饮对它们有降调作用。EMs大鼠体内JNK磷酸化的水平增高,JNK炎性通道可能参与了 EMs的免疫炎性效应,而丹枝饮对其有抑制作用。我们可以推测丹枝饮通过抑制JNK信号传导通路而降调炎性因子的表达。3.细胞实验:①目的:基于NIH3T3细胞验证“IL-17A/F—JNK—MCP-1/MIP-2”炎性信号传导通路,同时观察丹枝饮对这一炎性通道的作用靶点。②方法:予NIH3T3细胞IL-17A/F细胞因子刺激剂建立细胞模型,用ELISA方法和RT-PCR方法检测经不同处理后各组MCP-1和MIP-2的蛋白表达或相对基因表达;用蛋白质印迹(westernblot,WB)方法检测不同药物处理或干预后NIH 3T3细胞p-JNK蛋白水平;采用siRNA技术再次验证“IL-17A/F-JNK-MCP-1/MIP-2”炎性信号传导通路;采用流式液相多重蛋白定量技术(BD cytometric bead array,BD CBA)检测不同时间点JNK磷酸化水平。③结果:(1)IL-17A/F对NIH3T3表达MCP-1和MIP-2的影响:与空白组比较,给予不同浓度IL-17A/F或不同时间点干预后的NIH3T3细胞均可高表达MCP-1和MIP-2,其中IL-17A/F浓度为100ng/ml和干预时间为12小时时表达量最高(P<0.05)。(2)抑制JNK信号传导通道对NIH 3T3表达MCP-1和MIP-2的影响:与模型组比较,SP600125+IL-17A/F组的细胞表达MCP-1和MIP-2蛋白含量均降低(P<0.05)。(3)NIH 3T3细胞中IL-17RA和IL-17RC相对基因mRNA表达:与空白组比较,予IL-17A/F细胞因子刺激剂干预的模型组中IL-17RA和IL-17RC相对基因mRNA表达均降低(P<00.01)。(4)siRNA干扰成功后各组NIH 3T3细胞上清MCP-1和MIP-2蛋白表达:与IL-17A/F+Control siRNA比较,IL-17A/F+IL-17RAsiRNA 组和 IL-17A/F+IL-17RC siRNA 组中 NIH 3T3 细胞上清MCP-1 和 MIP-2 蛋白表达含量均降低(P<0.01)。IL-17A/F+IL-17RAsiRNA 组和 IL-17A/F+IL-17RC siRNA组比较,前者NIH 3T3细胞上清MCP-1和MIP-2蛋白表达含量较后者偏高(P<0.01)。(5)丹枝饮对MCP-1和MIP-2炎性因子蛋白和基因表达影响:与模型组比较,丹枝饮组和阿司匹林组MCP-1和MIP-2蛋白和mRNA含量均降低(P<0.01)。(6)丹枝饮对JNK磷酸化的影响:与模型组比较(Western Blot法),丹枝饮组和阿司匹林组p-JNK相对蛋白表达量均降低(P<0.05)。模型组内各时间点之间比较(BDCBA法),与空白对照(Omin)比较,120minJNK蛋白磷酸化水平无明显差异(P>0.05),5min、1Omin、20min、60minJNK 蛋白磷酸化水平均升高(P<0.05)。组内各时间点相互比较,1Omin时JNK蛋白磷酸化水平呈最高状态(P<0.05)。丹枝饮组和阿司匹林组各时间点JNK蛋白磷酸化趋势与模型组一致。同一时间点即5min、10min、20min、60min时与模型组比较,丹枝饮组和阿司匹林组JNK蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。④结论:首先,IL-17A/F可以诱导NIH3T3细胞分泌炎性趋化因子MCP-1和MIP-2,而JNK为其重要通道,验证了“IL-17A/F—JNK—MCP-1/MIP-2”炎性信号传导通路这一假说。其次,丹枝饮可以通过活血化瘀作用于“IL-17A/F—JNK—MCP-1/MIP-2”炎性信号传导通路而下调炎性因子的表达,从而起到治疗EMs慢性盆腔痛的作用。